Piecu aminoskābju dzēšana C57BL/6 peļu NKCC2 ietekmē NKCC2 fosforilācijas analīzi, bet neietekmē nieru darbību
Feb 19, 2022
IEVADS
Zīdītāja biezā augšupejošā ekstremitāte (TAL).nieresir izšķiroša nozīme ārpusšūnu šķidruma tilpuma, urīna koncentrācijas, kalcija (Ca 2 plus ) un magnija (Mg 2 plus ) homeostāzes, kā arī pH līdzsvara kontrolē. 1 Galvenais Na plus transportēšanas ceļš TAL ir Na plus - K plus - 2Cl - kotransporteris (NKCC2), ko īpaši inhibē cilpas diurētiskie līdzekļi. 1 Na plus , K plus un 2Cl - jonu koptransports caur NKCC2 ir elektroneitrāls, bet ir atkarīgs no elektrogēnās K plus sekrēcijas caur apikālu. nieruārējā medulla K plus kanāls ROMK. 2 NKCC2 mijiedarbība ar ROMK rada lūmenpozitīvu elektroķīmisko gradientu, kas uzlabo Na plus reabsorbciju un veicina Ca 2 plus un Mg 2 plus paracelulāro transportu. 3 NKCC2 nozīme TAL unnieru darbībapiemērs ir Bartera I tipa sindroms, ģenētisks traucējums, ko izraisa funkciju zuduma mutācijas NKCC2, kas izpaužas ar smagiemnierusāls un šķidruma izšķērdēšana, hipokaliēmiskā metaboliskā alkaloze un hiperkalciūrija. 3
NKCC2 ir membrānas transporta proteīnu šķīdinātāju nesēju saimes 12 (Slc12) loceklis, kas ietver arī visuresošo NKCC1 un distālo izliekto kanāliņu (DCT) specifisko Na plus - Cl - kotransportētāju (NCC). 2 NKCC2 aktivitāte pozitīvi korelē ar kotransportera fosforilēšanos pie vairākiem serīna un treonīna atlikumiem citoplazmas N-gala astē. 4 Aminoskābju sekvences, kas ieskauj šīs fosforilācijas vietas, ir ļoti konservētas, un tām ir augsta līdzības pakāpe starp NKCC2, NKCC1 un NCC. 2 NKCC2 fosforilēšanos stimulē vairāki hormonālie un nehormonālie ceļi. Hormoni, piemēram, arginīna vazopresīns (AVP) un angiotenzīns II (ANGII), stimulē NKCC2, palielinot cAMP veidošanos un aktivizējot proteīnkināzi A (PKA). Tiek uzskatīts, ka 5 PKA tieši fosforilē NKCC2 pie Ser126, kas uzlabo NKCC2 saturošu pūslīšu eksocitozi un līdz ar to transportera pārpilnību apikālajā plazmas membrānā. 6 Tāpat izmaiņas intracelulārā hlorīda koncentrācijās regulē NKCC2 fosforilāciju. Samazināta tracelulārā Cl-koncentrācija stimulē benolizīna (K) kināzes WNK1 un WNK4 fosforilēt un aktivizēt pakārtotās kināzes, ar Ste20- saistīto prolīna alanīnu bagāto kināzi (SPAK) vai oksidatīvo stresu reaģējošo kināzi 1 (OXSR1). ). 7- 9 Pēc saistīšanās ar "RFxV" motīvu NKCC2, šīs kināzes pēc tam fosforilē NKCC2 pie diviem treonīna atlikumiem (T96 un T101). 2 Šo atlikumu defosforilēšanu veic fosfatāzes kalcineirīns, uzsverot, ka NKCC2 ir mērķis vairākiem signalizācijas ceļiem. 10
Lai pētītu NKCC2 funkciju, vairākas grupas, tostarp mūsu, izstrādāja fosfoformam specifiskas antivielas pret Thr96 un / vai Thr101. 11- 17 Antivielas tika izmantotas, lai novērtētu NKCC2 fosforilāciju heterologās ekspresijas sistēmās 7, 11, 17, 18, 19, 20 un dzīvnieku modeļos, tostarp žurkām 10, 21, 22, 23, 24, 25 un pelēm. 14,15,16,17,19,26,27 Tomēr, izmantojot mūsu pT96/101 NKCC2 antivielu, mēs ieguvām nekonsekventus rezultātus dažādos peles modeļos. Kamēr mēs atklājām spēcīgus pNKCC2 signālus nierēs no pelēm 129Sv ģenētiskā fona, mēs nesaņēmām uzticamus pNKCC2 signālus nierēs no C57BL/6 pelēm, bet novērojām pNKCC2 antivielu krustenisko reaktivitāti ar pNCC. Citas laboratorijas, tostarp JA McCormick un AA McDonough (personīgā komunikācija), veica līdzīgus novērojumus. 18,28,29 Turklāt ir aprakstītas pārsteidzošas celmu atšķirības pelēmnierufunkcija 30, ieskaitot ievērojami mazāku Ca 2 plus izdalīšanos urīnā C57BL/6, salīdzinot ar 129Sv pelēm. Tāpēc mēs izvirzījām hipotēzi, ka C57BL / 6 peles ekspresē NKCC2 ģenētisko variantu, kas ietekmē NKCC2 fosforilāciju un, iespējams,nieru darbībakas izskaidro novērotās deformācijas atšķirības. Sekojošais pētījums tika izstrādāts, lai sistemātiski pārbaudītu šo hipotēzi.
Atslēgvārdi:jonu homeostāze, nieres, NKCC2, fosforilācija, celmu atšķirības
REZULTĀTI
2.1|C57BL/6 pelēm ir piecu aminoskābju dzēšana NKCC2, kas traucē fosforilētā NKCC2 noteikšanuPirmkārt, vairākām sugām mēs saskaņojām publicētās NKCC2 un NCC N-gala aminoskābju sekvences (transkripcijas ID tabulā S1) (attiecīgi 1A, B attēls), kas atbilst epitopiem, ko atpazīst anti-pNCC un anti-pNKCC antivielas. (1.C attēls). Izlīdzināšana apstiprināja NKCC2 un NCC 7 fosforilācijas vietu augsto saglabāšanās pakāpi, kas, iespējams, izskaidro mūsu un citu novēroto pNKCC2 un pNCC antivielu krustenisko reaktivitāti. 18,28,29 Interesanti un saskaņā ar mūsu hipotēzi, izlīdzināšana arī atkārtoti atklāja līdz šim nenovērtētu piecu aminoskābju dzēšanu NKCC2 secībā no C57BL/6 pelēm (ΔF97- T101) (1.A attēls). . DNS sekvencēšana no divām dažādām C57BL/6 peļu kolonijām, kas glabājas Džeksona laboratorijā ASV vai Janvier Labs Francijā, apstiprināja nukleotīdu dzēšanu C57BL/6 NKCC2 2. eksonā, kas atbilst iepriekš minētajai aminoskābju dzēšanai (S1 attēls). ,S2 tabula).
Lai raksturotu piecu aminoskābju atdalīšanas ietekmi uz kopējā un fosforilētā NKCC2 imūndetekcijas noteikšanu, mēs sistemātiski pētījām C57BL / 6 un 129Sv peļu nieres, izmantojot imūnhistoķīmiju un imūnblotēšanu. Imunofluorescence ar antivielu pret kopējo NKCC2 uzrādīja spēcīgu fluorescējošu signālu 129Sv un C57BL/6 peļu TAL apikālajā plazmas membrānā. Tomēr mūsu iepriekš izstrādātā pT96 / T101 NKCC2 antiviela uzrādīja spēcīgu TAL apikālu marķējumu tikai 129Sv pelēm, savukārt C57BL / 6 peļu TAL bija ļoti vāja imūnkrāsošana (1.D attēls). Atbilstoši tam Western blot analīze atklāja spēcīgu joslu kopējam NKCC2 abos peļu celmos, savukārt pT96/T101 NKCC2 antiviela konstatēja spēcīgu joslu paredzētajā izmērā (170 kDa) tikai 129Sv pelēm (1. attēls). Tā vietā C57BL/6 peļu nierēs tika atklāta josla pie 130 kDa, kas atbilst paredzamajam NCC izmēram (1. attēls). Līdzīgi rezultāti tika iegūti ar citām antivielām, kas iepriekš tika izmantotas NKCC2 fosforilācijas pētīšanai (S2 attēls). pT212/T217 NKCC1 R5 antiviela 11 papildus pNCC signālam uzrādīja vāju signālu paredzētajā pNKCC2 izmērā (S2 attēls). PNKCC2 imūnreaktīvā josla kļuva intensīvāka, kad tā bija svaiganierestika izmantoti lizāti. Lizes bufera izmantošana ar mazgāšanas līdzekļiem (RIPA buferis) neuzlaboja, bet gan samazināja signāla intensitāti (S3. attēls).
1. ATTĒLS pT96/T101 NKCC2 antiviela nekonstatē redzamu pNKCC2 signālu C57BL/6 pelēm. A, NKCC2 aminoskābju secību saskaņošana dažādām sugām un diviem peles celmiem 129Sv un C57BL/6. Dažādu sugu NKCC2 secību ID ir uzskaitīti S1 tabulā. Ļoti konservētais reģions, kas atbilst peles Thr96 līdz peles Thr101, ir atzīmēts pelēkā krāsā. B, NCC aminoskābju secību saskaņošana dažādās sugās. Dažādu sugu NCC secību ID ir norādīti S1 tabulā. C, parasti izmantoto un publicēto antivielu epitopu saraksts, kas atpazīst pT53 vai pT58NCC, kā arī pNKCC2 konservētajā lokusā ap Thr96 līdz Thr101. D, kopējā un pT96/T101 NKCC2 imūnkrāsošana secīgās peļu krio sekcijās ar 129Sv un C57BL/6 fonu. Mēroga josla=50 µm. E, imūnblots no kopējās un pT96/T101 NKCC2 pelēm ar 129Sv un C57BL/6 fonu. Vērtības ir vidēji ± SEM, n=5 peles katrā grupā, zaļās bultiņas norāda uz konkrētām joslām, bet sarkanās bultiņas norāda uz nespecifiskām joslām. Ir iekļauti molekulmasas marķieri. Paredzams, ka kopējās un pT96/T101 NKCC2 joslas ir 170 kDa. F, imūnbloti kopējai un pT96/T101 NKCC2, kopējai un pT53 un pT58 NCC NCC WT un NCC knockout (KO) pelēm ar dažādu izcelsmi. Zaļās bultiņas norāda uz konkrētajām joslām, savukārt sarkanās bultiņas norāda uz nespecifiskām joslām. Ir iekļauti molekulmasas marķieri. Kopējās un pT58 un pT53 NCC joslas ir sagaidāmas pie 130 kDa, kopējās un pT96/T101 NKCC2 joslas ir sagaidāmas pie 170 kDa
Lai pārbaudītu, vai mūsu pT96/T101 NKCC2 antiviela patiešām krusteniski reaģē ar fosforilētu NCC C57BL/6 pelēm, mēs pārbaudījāmniereslizāti no 129Sv un C57BL/6 savvaļas tipa pelēm un C57BL/6 NCC nokautām pelēm ar antivielām pret kopējo NKCC2, pT96/T101 NKCC2, kopējo NCC un fosforilēto NCC (pT53 un pT58 NCC) (1. attēls). Antiviela pT96/T101 NKCC2 un antivielas pret kopējo NCC un pNCC nekonstatēja joslas ar 130- 170 kDa C57BL/6 NCC nokautajām pelēm (1. attēls F). Interesanti, ka imūnblots, kā arī papildu imūnhistoķīmijas eksperimenti (attēls S4) norāda, ka ne tikai pNKCC2 antivielas krusteniski reaģē ar NCC pelēm C57BL/6, bet arī mūsu pNCC antivielas (pT53 NCC un pT58 NCC) krusteniski reaģē ar NKCC2 129Sv. pelēm izmantotajās koncentrācijās.
Kalcija un magnija izdalīšanās urīnā atšķiras starp 129Sv un C57BL/6 pelēm
Lai noteiktu, vai dzēšana (F97- T101) NKCC2 var būt saistīta ar fizioloģiskām atšķirībām starp 129Sv un C57BL/6 pelēm, mēs salīdzinājām ūdens uzņemšanu, plazmas jonu līmeni un urīna šķidruma un jonu izdalīšanos starp diviem peļu celmiem. Kā apkopots 1. tabulā, lielākā daļa novērtēto parametru starp celmiem neatšķīrās. Tomēr C57BL/6 pelēm bija mazāks Ca 2 plus urīna daudzums un lielāka Mg 2 plus izdalīšanās urīnā nekā 129Sv pelēm. Ca 2 plus un Mg 2 plus līmenis plazmā bija līdzīgs abām grupām, kas liecina, ka peles atradās līdzsvara stāvoklī, kurā homeostatiskais līdzsvars starp reabsorbciju zarnās, audu mobilizāciju (piemēram, no kauliem) unnierutika sasniegta Ca 2 plus un Mg 2 plus jonu izvadīšana. Lai pārbaudītu, vai atšķirīgie Ca 2 plus un Mg 2 plus izdalīšanās ātrumi urīnā rodas no atšķirībām šo jonu uzsūkšanā zarnās, mēs salīdzinājām ikdienas pārtikas uzņemšanu, izkārnījumu un izkārnījumos esošo Ca 2 plus un Mg 2 plus izdalīšanos no šiem diviem. peles celmi. Kā parādīts S5 attēlā, barības uzņemšana un fekāliju Ca 2 plus izvadīšana bija līdzīgas, taču ikdienas Mg 2 plus izdalīšanās ar izkārnījumiem C57BL/6 pelēm bija mazāka nekā 129Sv pelēm, kas liecina, ka C57BL/6 pelēm ir augstāka Mg 2 plus reabsorbcija zarnās. nekā 129Sv pelēm. Saskaņā ar šo pieņēmumu, C57BL/6 pelēm bija spēcīgāka magnija kanāla TRPM6 ekspresija resnās zarnās (S6. attēls), kā arī tendence uz augstāku Mg 2 plus līmeni plazmā, salīdzinot ar 129Sv pelēm, lai gan atšķirības nesasniedza statistisku nozīmīgumu. Lai novērtētu iespējamo kaula ieguldījumu, mēs ar mikro-CT analizējām kaulu minerālo blīvumu abos celmos. Līdzīgi kā iepriekšējos ziņojumos, 32 C57BL/6 pelēm bija diezgan zems kaulu minerālais blīvums (S7 attēls), kas var izskaidrot, kāpēc šīm pelēm ir tendence saglabāt Ca 2 plus jonus, izmantojot samazinātu daudzumu.nieruCa 2 plus izdalīšanās. Atbilstoši pastiprinātam cauruļveida Ca 2 plus reabsorbcijas ātrumam, C57BL/6 peļu nieres
proteīna līmenī ekspresēja vairāk TRPV5 Ca 2 plus kanālu nekā 129Sv peļu nierēs (2. attēls). C57BL/6 pelēm bija arī ievērojami lielāka NCC mRNS un olbaltumvielu ekspresija nekā 129Sv pelēm (2.A attēls). Tāpat kopējā NKCC2, kopējā un fosforilētā NCC un kopējā ENaC proteīnu pārpilnība C57BL/6 bija augstāka nekā 129Sv pelēm (attēls 2B, C). Proteolītiski šķelto un līdz ar to aktīvo ENaC formu daudzums neatšķīrās, kas liecina, kanieruENaC aktivitāte bija līdzīga abiem celmiem (2.B, C attēls).
Nav pierādījumu par izmainītu biezu augšupejošu ekstremitāšu funkciju C57BL/6 pelēm, salīdzinot ar 129Sv pelēm
Lielāks kopējā NKCC2, kopējā NCC un fosforilētā NCC daudzums C57BL/6 peļu nierēs var būt kompensējoša reakcija uz samazinātu NKCC2 fosforilāciju. Lai pārbaudītu, vai NKCC2 un NCC aktivitāte atšķiras starp peles celmiem, mēs veicām attiecīgi bumetanīda un tiazīda testu. Vienreizēja bumetanīda vai hidrohlortiazīda injekcija izraisīja spēcīgu natriurēzi, kas bumetanīdam bija izteiktāka nekā hidrohlortiazīdam. Tomēr diurētiskās atbildes reakcijas abos celmos bija pilnīgi līdzīgas, kas liecina, ka NKCC2 un NCC funkcionālās aktivitātes C57BL/6 un 129Sv pelēm neatšķīrās (3.A-D attēls). Acīmredzot olbaltumvielu pārpilnība un fosforilācijas līmenis ne vienmēr atbilst funkcionālajām aktivitātēmnierujonu transporta proteīni, kā nesen norādīja Hanters un kolēģi. 33 Lai tālāk novērtētu TAL funkciju, mēs veicām ūdens ierobežošanas testu, kurā pelēm 24 stundas bija piekļuve samitrinātai pārtikai, bet ne krāna ūdenim. Šādos apstākļos abi peļu celmi palielināja urīna osmolaritāti līdz līdzīgām vērtībām (1. Turklāt C57BL / 6 pelēm un 129Sv pelēm bija tāda pati uromodulīna (Tamm-Horsfall proteīna) izdalīšanās ar urīnu (1. tabula), kas tiek ražots un izdalīts urīnā atkarībā no TAL šūnu funkcionālās aktivitātes. 3
129Sv un C57BL/6 peļu krustošanās liecina, ka piecu aminoskābju dzēšana NKCC2 neatdala konkrētu fenotipu
Iesniegtie dati liecina, ka celmu atšķirības urīna jonu izdalījumos unnieruolbaltumvielu pārpilnība nav saistīta ar piecu aminoskābju dzēšanu C57BL/6 NKCC2, bet ir saistīta ar citām ģenētiskām atšķirībām starp diviem peles celmiem. Lai to pārbaudītu tālāk, mēs krustojām 129Sv un C57BL/6 peles līdz F2 paaudzei, kurā ģenētisko celmu atšķirībām (tostarp NKCC2) jābūt nejaušām.
izplatīts pelēm. Pēc tam mēs salīdzinājām F2 peles, kuras bija vai nu homozigotas pilna garuma NKCC2 (f/f), homozigotas attiecībā uz NKCC2 dzēšanu (Δ/Δ) vai heterozigotas attiecībā uz NKCC2 dzēšanu (f/Δ). Izņemot paredzamos atšķirīgos fosfoformam specifisko antivielu saistīšanās modeļus pret NKCC2 un NCC (un neskaidru ROMK ekspresijas atšķirību mRNS, bet ne proteīna līmenī), neviena no iepriekš konstatētajām atšķirībām starp abiem celmiem nebija acīmredzama. F2 paaudzes f/f, Δ/Δ vai f/Δ peles (4. attēls un 2. tabula). Jo īpaši nebija atšķirību Ca 2 plus vai Mg 2 plus izdalīšanā urīnā, kā arī nebija atšķirību plazmas Ca 2 plus vai Mg 2 plus līmeņos, kas liecina, ka celmu atšķirības starp 129Sv un C57BL/6 pelēm nav atkarīgas no piecu aminoskābju dzēšana NKCC2.
Jauna pT96 NKCC2 antiviela nosaka pNKCC2 abos celmos
Tā kā piecu aminoskābju dzēšana NKCC2 kavē ticamu NKCC2 fosforilācijas noteikšanu C57BL/6 pelēm, izmantojot pieejamās antivielas, mēs radījām jaunu antivielu, kas vērsta pret T96 fosfātu C57BL/6 pelēm. Truši tika imunizēti ar fosfopeptīdu, kas atbilda C57BL/6 NKCC2 aminoskābju secībai, kas ieskauj T96 (YYLQ(p)TMDA). Antiserumi tika attīrīti ar afinitāti un raksturoti ar imūnblotēšanu un imūnhistoķīmiju (5. attēls). Antiviela atklāja vienu joslu ar paredzamo izmēru 170 kDa nierēs ar 129Sv, C57BL/6 savvaļas tipa un C57BL/6 NCC nokautu.
pelēm (5.A attēls). Josla skaidri atšķīrās no tās, kas tika noteikta NCC pie 130 kDa. 129Sv defosforilēšananieresparaugi ar teļa zarnu sārmaino fosfatāzi (CIAP) pilnībā iznīcināja signālu, kas iegūts ar jauno pT96 NKCC2 antivielu, savukārt signāls ar nefosfoformai specifisko NKCC2 antivielu bija redzams kontroles un defosforilētajos paraugos (5.B attēls). Interesanti, ka arī NKCC2 fosforilācija lielā mērā tika novērstaniereslizāti tika inkubēti 37 grādu temperatūrā 1 stundu bez CIAP (iespējams, endogēnās sārmainās fosfatāzes aktivitātes dēļ no proksimālajiem kanāliņiem). Defosforilēšanas eksperimenti, izmantojot lambda fosfatāzi secīgās C57BL/6 peļu parafīna-nieru sekcijās, vēl vairāk apstiprināja, ka jaunā antiviela atpazīst tikai fosforilētu NKCC2 (5.C attēls). Turklāt imūnfluorescence pēc secīgām krio sekcijām parādīja, ka jaunā antiviela krāso tikai NKCC2- pozitīvo TAL apikālo plazmas membrānu, bet ne NCC pozitīvo DCT 129Sv un C57BL/6 pelēm (5.D attēls), kas liecina, ka jaunā antiviela pNKCC2 antiviela krusteniski nereaģē ar pNCC. Šis secinājums tika apstiprināts arī, izmantojot šūnu lizātus no MDCKI šūnām, kas ekspresē cilvēka NKCC2 (hNKCC2) un cilvēka NCC (hNCC). Imunoprecipitāciju (IP) un visu šūnu lizātu imūnbloti parādīja, ka jaunā pT96 NKCC2 antiviela atpazīst cilvēka NKCC2, bet ne cilvēka NCC (S8A attēls). Interesanti, ka, lai gan jaunā antiviela tika radīta pret C57BL/6 peļu pNKCC2, jaunā antiviela konstatēja NKCC2 fosforilēšanos abu peļu celmu nierēs, izmantojot gan imūnhistoķīmiju (6.A attēls), gan imūnblotēšanu (6.B attēls).
Jaunā pT96 NKCC2 antiviela ļauj analizēt regulētu NKCC2 fosforilāciju
NKCC2 un NCC fosforilāciju un līdz ar to aktivitāti regulē ārpusšūnu jonu koncentrācija. Zems [Cl − ] ex palielina NKCC2 fosforilēšanos pie Thr96 un Thr101 un NCC fosforilēšanos pie Thr53 un Thr58, aktivizējot WNK/SPAK/OSR1 ceļu. 7, 8, 18, 29, 35 Tāpat augsts [K plus ] strauji samazina NCC fosforilāciju, bet tiek uzskatīts, ka tam ir maza ietekme uz NKCC2 fosforilāciju vai tā neietekmē vispār. 12,36,37,38 Lai pārbaudītu, vai jaunizveidotā pT96 NKCC2 antiviela spēj noteikt šāda veida diferenciālo NKCC2 fosforilācijas regulējumu,nieresC57BL/6 peļu šķēles ex vivo tika pakļautas attiecīgi 110 vai 5 mM [Cl-] ex un 3 vai 10 mM [K plus] ex. Kā gaidīts, zemais [Cl - ] ex spēcīgi palielināja NCC un NKCC2 fosforilāciju (7.A, B attēls), savukārt augstais [K plus] ex tikai samazināja NCC fosforilāciju, bet nemainīja NKCC2 fosforilāciju (7.C, D attēls). Tāpat jaunā antiviela tika atklāta tikpat labi mainīta
4. ATTĒLS Nav būtisku izmaiņu galvenā mRNS un olbaltumvielu ekspresijānierujonu transportētāji un kanāli krustojumā F2 paaudzē. A, relatīvo mRNS ekspresijas līmeņu joslu diagramma trīs peļu grupās. Visas vērtības tika normalizētas f / f pelēm. Vērtības ir vidēji ± SEM. B, olbaltumvielu pārpilnība pelēniereslizāti no F2 paaudzes dzīvniekiem. Trīs grupas atbilst pilna garuma NKCC2 (f / f), NKCC2, kas ir homozigots dzēšanai (Δ / Δ) vai NKCC2, kas ir heterozigots dzēšanai (f / Δ /). Ir iekļauti molekulmasas marķieri. NKCC2 un pNKCC2 paredzēts pie 170 kDa, NCC un pNCC pie 130 kDa, TRPM6 pie 260 kDa, - ENaC pie 95 kDa un 34 kDa (šķelts), - ENaC pie 100 kDa, - ENaC pie 100 kDa un 85 kDa (šķelts) , ROMK pie 55 kDa (nobriedis glikozilēts), 43 kDa (glikozilēts kodols) un 34 kDa (neglikozilēts). Zaļās bultiņas norāda uz konkrētajām joslām, savukārt sarkanās bultiņas norāda uz nespecifiskām joslām. C, proteīnu pārpilnības densitometriskā analīze, salīdzinot f / f un Δ / Δ peles. Joslu intensitāte no Δ / Δ pelēm tiek normalizēta ar intensitāti no f / f. (Vērtības ir vidēji ± SEM; n=5 peles/grupa; *P < 0,05,="" †="" p="">< 0,01,="" ‡="" p=""><>
NKCC2 fosforilācija, kas tika izraisīta MDCKI šūnās, kas ekspresē cilvēka NKCC2 (hNKCC2) vai peles NKCC2 (mNKCC2 (C57BL/6)) hipotoniski zema ekstracelulārā hlorīda apstākļos (S8B attēls). Innieresšķēles, kas inkubētas pie 5 mM [Cl − ] ex , arī iepriekš aprakstītās anti-peles pT96/T101 NKCC2 39 un anti-cilvēka pT212/T217 NKCC1 R5 11 antivielas nosaka vājus signālus NKCC2 un NCC, kas kļūst skaidrāki, kad tiek ielādēts vairāk olbaltumvielu un imūnbloti tiek attēloti uzlabotos iestatījumos (S9. attēls).
DISKUSIJA
C57BL/6 un 129Sv peles ir divi no biomedicīnas pētījumos visbiežāk izmantotajiem peļu celmiem. C57BL/6 peļu genoms bija pirmais, kas tika sekvencēts pelei 40, un kopš tā laika ir kalpojis kā atsauces genoms ģenētisko un fenotipisko variāciju analīzei starp peles celmiem. 41- 44 PriekšnieresPētījumos viena būtiska atšķirība starp C57BL/6 un 129Sv pelēm attiecas uz renīna gēna ekspresiju. Tāpat kā cilvēkiem, arī C57BL/6 pelēm ir tikai viens renīna gēns, savukārt 129Sv pelēm ir divas kopijas, kas var izskaidrot šī peles celma lielāku jutību pret hipertensiju 45, 46 un hipertensijas ievainojumiem. 47 Ar šo pētījumu mēs pievienojam vēl vienu svarīgu ģenētisku atšķirību, kas jāņem vērā. Mēs aprakstām līdz šim nenovērtētu piecu aminoskābju dzēšanu NKCC2 (ΔF97- T101), kas atrodas C57BL/6, bet ne 129Sv pelēm, kas traucē NKCC2 fosforilēšanās noteikšanu ar lielāko daļu iepriekš pieejamo antivielu, bet būtiski neietekmē. ietekmenieru darbība.
Peles NKCC2 N-gala fosforilācijas vietas T96 un T101 ir ļoti konservētas starp sugām un starp NKCC2, NKCC1 un NCC (1. attēls). Tāpēc nav pārsteidzoši, ka antivielas, kas vērstas pret šīm fosforilācijas vietām, krusteniski reaģē ar citiem kotransportieriem. Iepriekšējie pētījumi ir ziņojuši, ka antivielas pret fosforilētu NCC nosaka arī fosforilētu NKCC2 7,18,28,29 un ka pNKCC1 antiviela ļauj analizēt gan NKCC1, gan NKCC2 fosforilācijas līmeņus. 11 Saskaņā ar to mēs novērojām mūsu pNCC (pT53 un pT58) antivielu krustenisko reaktivitāti ar fosforilētu NKCC2 un mūsu pT96/pT101 NKCC2 antivielu ar fosforilētu NCC. Tomēr pNCC antivielu krusteniskā reaktivitāte ar NKCC2 tika novērota tikai 129Sv peļu nierēs, bet ne C57BL / 6 peļu nierēs. Un otrādi, mūsu iepriekš izstrādātā antiviela pret NKCC2 pT96/pT101 neuzrādīja pNKCC2 signālu vai labākajā gadījumā ļoti vāju signālu C57BL/6 peles nierēs un šajā celmā konstatēja galvenokārt fosforilētu NCC. Tagad mēs saistām šos mulsinošos novērojumus ar piecu aminoskābju dzēšanu NKCC2 pelēm C57BL6 (ΔF97- T101). NKCC2 fosforilācijas regulēšana ir pētīta
ied dažādos eksperimentālos apstākļos un dažādiem stimuliem, tostarp vazopresīnam, 14,21,24,25,49 uromodulīnam 19,20,50 un kalcineirīna inhibitoriem. 10,26 Lai gan lielākā daļa pētījumu tika veikti ar heterologām ekspresijas sistēmām 10, 19, 20, 25, 50 vai žurkām 10, 24 un pelēm 19, 26, kas ekspresē pilna garuma NKCC2, daži pētījumi tika veikti arī ar C57BL/6 pelēm. 7,18,27,28,29,51 Kā mēs ziņojam šeit, C57BL/6 pelēm ir NKCC2 variants ar piecu aminoskābju dzēšanu, kas traucē pareizu NKCC2 fosforilācijas noteikšanu un rada risku, ka standarta pT96/T101 NKCC2 antivielas un R5 anti-fosfo-NKCC1 antiviela krusteniski reaģē ar fosforilētu NCC vismaz mūsu darbā izmantotajos apstākļos. Nav iespējams spriest par šīs savstarpējās reakcijas ietekmi uz iepriekšējiem eksperimentālajiem secinājumiem, taču saskaņā ar mūsu novērojumiem dati no C57BL/6 pelēm ir jāpārskata un jāinterpretē piesardzīgi. Neskatoties uz to, ka piecu aminoskābju dzēšanai bija spēcīga ietekme uz NKCC2 fosforilācijas noteikšanu, mums nav pierādījumu, ka dzēšana būtiski ietekmētu kotransportera funkcionālo aktivitāti. C57BL/6 pelēm faktiski bija lielāka Mg 2 plus izdalīšanās urīnā un mazāka Ca 2 plus izdalīšanās urīnā 31 nekā 129Sv pelēm, taču mēs noskaidrojām, ka šīs atšķirības, iespējams, nav saistītas ar šo katjonu izmainītu paracelulāro transportu gar TAL. uzlabotas TRPM6- atkarīgās Mg 2 plus uzņemšanas zarnās un palielinātas TRPV5- atkarīgās Ca 2 plus reabsorbcijas rezultāts DCT2 un CNT. Pēdējais izraisa pozitīvu Ca 2 plus līdzsvaru, kas var palīdzēt palielināt zemo kaulu minerālo blīvumu C57BL/6 pelēm. Secinājums, ka C57BL/6 un 129Sv peles parāda to pašunierureakcijas uz cilpas un tiazīdu diurētiskiem līdzekļiem un ūdens ierobežošanu vēl vairāk liecina, ka piecu aminoskābju dzēšana NKCC2 būtiski neietekmē TAL funkciju. Vissvarīgākais ir tas, ka krustotu C57BL/6 un 129Sv peļu F2 paaudzes pelēm ir tāda patinierufenotips neatkarīgi no tā, vai peles izsaka pilna garuma (f / f) NKCC2 vai NKCC2
homozigots (Δ/Δ) dzēšanai. Šie novērojumi pelēm atbilst iepriekšējiem funkcionālajiem datiem no heterologām ekspresijas sistēmām. Kamēr atsevišķu atlieku mutācijas NKCC1 (T217 cilvēkam, T211 pelei) vai NCC (T60 cilvēkam, T58 pelei) atceļ šo kotransporteru aktivitāti, tad atbilstošā atlikuma mutācijas NKCC2 (T105 cilvēkam, T101 pelei) ) diezgan maz vai pat neietekmē sākotnējo un stimulēto NKCC2 aktivitāti. 35, 52, 53 Pat tad, ja abi treonīna atlikumi NKCC2 ir mutēti par alanīnu, NKCC2 funkcionālā aktivitāte joprojām sasniedz ~ 70 procentus no maksimālās aktivitātes 35, kas liecina, ka šo vietu fosforilācija ir indikatīva, bet nav būtiska NKCC2 aktivitātei.
Fosforilācijas vietas bieži ir homologas starp olbaltumvielām. Tādējādi fosfoformu specifisko antivielu krusteniskās reakcijas problēma nav unikāla antivielām, kas vērstas pret fosforilētu NCC, NKCC2 un NKCC1, bet tika ziņots arī par citiem proteīniem, piemēram, ciklīna atkarīgajām kināzēm 1 un 2 54 un ārpusšūnu kināzēm. signālu regulētās kināzes 1 un 2. 55 Konsekventi, kad tiek izmantotas fosforilācijas stāvoklim specifiskas antivielas, ir nepieciešamas stingras eksperimentālās kontroles, lai apstiprinātu atklāto signālu specifiku. Tas var ietvert (a) apstiprinājumu, ka izmantotā antiviela nosaka proteīnu paredzamajā molekulmasā (imūnblotēšana) un/vai paredzamajā šūnu un subcelulārajā lokalizācijā (imunofluorescence), (b) pārbaudi, vai antiviela specifiski mijiedarbojas ar fosforilēto epitopu, izmantojot konkurences testus ar fosforilētiem un nefosforilētiem peptīdiem, un c) demonstrējot, ka
antiviela ir specifiska fosfoformai, salīdzinot fosforilētos un defosforilētos audu paraugus. Šīs kontroles var papildināt ar ģenētiskām kontrolēm, kas ietver audu testēšanu no nokautiem dzīvniekiem un/vai šūnām, kas heteroloģiski ekspresē interesējošo proteīnu. Šajā pētījumā mēs izmantojām iepriekš minētās pieejas, lai rūpīgi raksturotu jaunu pT96 NKCC2 antivielu, kas nosaka fosforilētu NKCC2nieresparaugi no C57BL/6 un 129Sv pelēm vienlīdz labi. Antiviela ir specifiska fosfoformai un nevienā no pārbaudītajiem apstākļiem neuzrāda acīmredzamu krustenisku reaktivitāti ar fosforilētu NCC. Izmantojot šo antivielu, mēs apstiprinājām, ka zemas ārpusšūnu hlorīda koncentrācijas palielina NKCC2 fosforilēšanos šajā vietā, 7, 8, savukārt mainītajai ekstracelulārajai kālija koncentrācijai nav būtiskas regulējošas lomas. 24 Visbeidzot, mūsu darbs atklāj kritisku celmu atšķirību peles NKCC2 aminoskābju secībā, kas ietekmē NKCC2 fosforilācijas un regulēšanas noteikšanu un līdz ar to arī analīzi. Jaunizstrādātā pT96 NKCC2 antiviela apiet šo tehnisko brīdinājumu un ļauj droši noteikt izmainītu NKCC2 fosforilāciju neatkarīgi no peles modeļu ģenētiskā fona. Turklāt mūsu pētījumā vēlreiz uzsvērts, ka, analizējot peles modeļus, jāņem vērā ģenētiskā fona atšķirības.
MATERIĀLI UN METODES
Dzīvnieki,Peļu tēviņi, kas atbilst vecumam (6- 8 nedēļas), bija vai nu no inbred celmiem 129S6/SvEvTac, C57BL/6J, turpmāk saukti par 129Sv un C57BL/6, vai no jaukta hibrīda celma 129S/B6 F2 paaudzē. Visi eksperimenti ar dzīvniekiem tika veikti saskaņā ar Šveices dzīvnieku labturības likumiem, un tos apstiprināja Šveices Cīrihes kantona veterinārā administrācija (licences: 141/2014, 185/2017 un 135/2018). Pelēm tika noteikts genotips, lai dzēstu 15 bāzes, izmantojot standarta PCR ar primeriem, kas sniegti S3 tabulā. Pilna garuma (f / f) NKCC2 paredzamais PCR produkts ir 87 bp, savukārt dzēstā NKCC2 secība (Δ / Δ) ir paredzama 70 bp.
Audu apstrādePeles tika anestēzētas ar izoflurāna (2 procenti - 4 procenti, 0,5 l/min; Provet; CH) un Temgesic (buprenorfīns; 0.05- 0) kombināciju. 4 mg/kg ķermeņa svara; Indivor; CH). Bioķīmiskai analīzei peles tika anestēzijas un caur sirds kreiso kambara perfūziju ar fosfātu buferētu fizioloģisko šķīdumu (PBS). Nieres un distālās resnās zarnas tika novāktas, ātri sasaldētas šķidrā slāpeklī un uzglabātas –80 grādos līdz turpmākai apstrādei. Imūnhistoķīmijai nieres tika fiksētas, izmantojot 3% paraformaldehīdu (PFA) 0,1 M fosfāta buferšķīdumā (pH 7,4, 300 mOsm), izmantojot dziļi anestēzētas peles retrogrādu perfūziju caur vēdera aortu, kam seko īsa skalošana ar 0,1 M fosfāta buferšķīdumu (0,2 M NaH 2 PO 4 x H 2 O, 0,2 M NaH 2 PO 4 x 2H 2 O, 0,1 M CaCl 2). Pēc tam nieres tika izņemtas, sagrieztas gabalos un sasaldētas šķidrā propānā un uzglabātas -80 grādu temperatūrā.
Metabolisma būru pētījumiPēc pielāgošanās vielmaiņas būriem (Techniplast) peles tika turētas vielmaiņas būros četras dienas pēc kārtas ar brīvu piekļuvi krāna ūdenim un standarta laboratorijas ēdienam (Ssniff, Spezialdiäten GmbH). Ķermeņa svars, pārtikas un ūdens patēriņš tika reģistrēts katru dienu, un 24 stundas tika savākts urīns un izkārnījumi.
Ūdens ierobežošanas protokolsPeles 24 stundas tika turētas vielmaiņas būros (Techniplast) bez piekļuves krāna ūdenim. Standarta laboratorijas barības pulveris (Ssniff, Spezialdiäten GmbH) tika sajaukts ar ūdeni 1:1, tika savākts un analizēts 24 stundu urīns un fekālijas. Pēc 24 stundām peles tika ievietotas atpakaļ normālos būros (T 2L (IVC), LASC, UZH).
Bioķīmiskie mērījumiNa plus , K plus , Ca 2 plus koncentrācija urīnā tika analizēta ar liesmas fotometriju (EFOX 5053, Eppendorf). Mg 2 plus koncentrācija urīnā un plazmā tika mērīta Cīrihes Integratīvās grauzēju fizioloģijas centrā ar SYNCHRON LX ® sistēmu(-ām), UniCel ® DxC 800 Synchron ® Clinical System un Synchron ® System Multi Calibrator. Urīna kreatinīns tika mērīts pēc Jaffe metodes. Asins gāzu un jonu koncentrācijas tika mērītas heparinizētās pilnās asinīs, izmantojot ABL825Flex asins gāzu analizatoru (radiometru) tūlīt pēc asiņu savākšanas no dobās vēnas. Plazmas aldosterona līmenis un uromodulīna (UMOD) koncentrācija urīnā tika mērīta ar komerciāli pieejamiem ELISA komplektiem (attiecīgi Aldosterona ELISA komplekts no Cayman; #501090 un Mouse Uromodulin ELISA komplekts no Abcam; ab245726).
Reālā laika kvantitatīvā polimerāzes ķēdes reakcija (RT-qPCR)
RNS tika izolēta no nierēm un distālās resnās zarnas, izmantojot SV kopējās RNS izolācijas komplektu (PROMEGA). Vienādas izolētas RNS koncentrācijas (250 ng 129Sv pret C57BL/6 vai 500 ng f/f, Δ/Δ un f/Δ) tika reversi transkribētas cDNS ar GoScript™ reversās transkriptāzes komplektu (PROMEGA). Izveidotās cDNS tika tālāk atšķaidītas ar DNSāzes/RNS nesaturošu ūdeni (1:5). Primeri tika izstrādāti kopējā Slc12a1, Slc12a3, Trpm6, Trpv5, Scnn1a, Scnn1b, Scnn1g un Kcnj1 kvantitatīvai noteikšanai (S3 tabula). Kvantitatīvā PCR analīze tika veikta, izmantojot LightCycler ® 480 (Roche), lai noteiktu interesējošo gēnu ekspresijas līmeņus. Relatīvā gēnu ekspresija tika aprēķināta, izmantojot delta Ct metodi, izmantojot -aktīnu kā atsauces gēnu.
Western blot analīzeNieres tika homogenizētas bez mazgāšanas līdzekļa līzes buferšķīdumā (DFLB), kas satur mannītu 200 mM, HEPES [4- (2- hidroksietil)- 1piperazīnsulfonskābes. skābes] 80 mM, kālija hidroksīds 41 mM, proteāzes inhibitori (Complete Ultra, Roche) un fosfatāzes inhibitori (PhosSTOP, Roche), izmantojot 32 Magna Lyser Green Beads (Roche) audu homogenizatorā Precellys 24 (Bertin Instruments, Montigny-le-). Bretonnē). Pērlītes tika nogulsnētas, centrifugējot 10 minūtes (1987 rcf), un proteīnu saturošais supernatants tika uzglabāts vienreizējās lietošanas alikvotās daļās -80 grādu temperatūrā. Western blotam 50 µg proteīna tika denaturēti Laemmli buferšķīdumā, atdalīti ar SDS-PAGE, izmantojot 8% - 12% gēlus, un pēc tam pārnesti uz nitrocelulozes membrānām. Nespecifiskās saistīšanās vietas tika bloķētas, izmantojot 1x Odyssey bloķējošo šķīdumu (Li-COR Biosciences), pirms membrānas tika inkubētas ar primārajām antivielām (S4 tabula), kas atšķaidītas 0,2x Odyssey bloķējošā šķīdumā 4 grādu temperatūrā 12 stundas. Pēc mazgāšanas PBS- 0.1 procents Tween, membrānas tika inkubētas ar sekundārajām antivielām (kazas-anti-trušu IRDye 800 vai kazas-anti-peles IR dye 680, 1:10'000, LI - COR Biosciences), kas atšķaidīts 0,1x kazeīna bloķēšanas buferšķīdumā (Sigma). Atklātās joslas tika vizualizētas ar Odyssey infrasarkano staru attēlveidošanas sistēmu (Li-COR Biosciences). Lai nodrošinātu vienādu proteīna slodzi, pirms antivielu noteikšanas membrānas tika iekrāsotas kopā ar antivielu pret aktīnu, vai arī kopējais proteīns tika iekrāsots, izmantojot REVERT Total Protein Stain (Li-COR Biosciences). Imūnreaktīvās joslas tika kvantitatīvi noteiktas Fidži (ImageJ) un normalizētas attiecīgi pret aktīna signālu vai REVERT kopējo proteīna traipu.
ImūnhistoķīmijaKriostata sekcijas (biezums 4 µm) tika bloķētas nespecifisku antivielu saistīšanai ar 10% normālu kazas serumu un pēc tam inkubētas ar primārajām antivielām (S4 tabula).
naktī 4 grādi. Pēc mazgāšanas ar 1X PBS priekšmetstikliņus inkubēja ar sekundārajām antivielām (Cy3 – konjugēts kazas anti-truša IgG, produkta numurs 111- 165- 144, 1:1000 un FITC – konjugēts kazas anti-peles IgG , produkta numurs 115- 095- 068, attiecīgi 1:100, abi no Jackson Immuno Research Laboratories) 2 stundas istabas temperatūrā. Visas antivielas tika atšķaidītas ar 1 procentu BSA/1xPBS. Šūnu kodoli tika iekrāsoti ar DAPI (4′, 6- Diamidino- 2- phentil-indol, Sigma-Aldrich, Co.) koncentrācijā 0,1 µg/ml. Attēlveidošana tika veikta, izmantojot Leica DM6000 B fluorescences mikroskopu (Leica Microsystems, 35578) ar Leica DFC350 FX fluorescences vienkrāsas digitālo kameru (Leica Microsystems, 35578). Attēli tika apstrādāti Fidži (ImageJ).
Afinitātes attīrītas trušu anti-peles pT96 NKCC2 antivielas ģenerēšanaAntivielu ražošanu veica Pineda antivielu dienests (Berlīne, Vācija). Truši tika imunizēti ar fosfopeptīdu, kas satur aminoskābes 105- 114 no C57BL/6 peles NKCC2 sekvences (NH2- YYLQ(p) TMDAV-COOH). Monospecifiskā IgG frakcija tika ar afinitāti attīrīta pret fosfopeptīdu un pēc tam iepriekš absorbēta ar defosfopeptīdu, kā rezultātā tika iegūta fosfoformai specifiska antivielu frakcija. Šīs frakcijas antivielu specifika tika pārbaudīta ar imūnhistoķīmisku un Western blot analīzi (5. attēls un S4 attēls).
Fosfatāzes ārstēšanaOlbaltumvielu lizātus 1 stundu inkubēja 37 grādos ar teļa zarnu sārmaino fosfatāzi (CIAP) (1 U/1 µg proteīna), lai izraisītu fosforilētu proteīnu 5'-fosfātu grupu hidrolīzi, kas kavē pT96 specifisko saistīšanos. NKCC2 antiviela pret proteīniem uz nitrocelulozes Western blot membrānas (5.B attēls). Tika izmantotas arhivētas parafīnā iestrādātas nieres no C57BL6 pelēm. Sekciju apstrāde, izmantojot teļa zarnu sārmaino fosfatāzi (Sigma Aldrich), tika veikta, kā aprakstīts iepriekš, ar nelielām izmaiņām. 56 Pēc brīvo aldehīdu grupu bloķēšanas sekcijas piecas reizes skalotas sārmainās fosfatāzes buferšķīdumā (100 mm Tris, 50 µm CaCl 2, 0,1 mm MgCl 2, 8,4 µm leupeptīns, 4 mm Pefablock pH 9,0). Vēlāk sekcijas tika inkubētas sārmainās fosfatāzes buferšķīdumā ar vai bez teļa zarnu sārmainās fosfatāzes (~130 vienības/ml) inkubatorā 35 grādu temperatūrā 2 stundas. Pēc tam tika veikta imūnhistoķīmija un gaismas mikroskopija, kā norādīts detalizēti. 57
Aminoskābju secību saskaņošanaDažādu sugu un peļu celmu aminoskābju sekvences tika iegūtas no atvērtās datu bāzes "Ensembl Genome Browser" (www.ensem bl.org, Sanger Institute). 42 Atšifrējumu ID avoti ir norādīti S1 tabulā. Sekvences tika izlīdzinātas, izmantojot Qiagen © CLC Main Workbench 20.
Nieru šķēlesNieresC57BL / 6 peļu šķēles tika izmantotas ex vivo eksperimentiem, kā aprakstīts iepriekš. 12 Īsumā, peles tika badā uz nakti ar brīvu piekļuvi ūdenim, lai izvairītos no iespējamās uztura jonu uzņemšanas ietekmes uz NKCC2 un NCC fosforilācijas līmeni. Anestētajiem dzīvniekiem tika izņemtas nieres, sagrieztas 280 µm biezās šķēlēs, izmantojot vibrējošu mikrogriezēju (Vibratome, Microm; Thermo Scientific), un ievietotas Ringera šķīdumā (mM): 98,5 NaCl, 25 NaHCO 3, 3 KCl, 1 Na2 HPO 4, 2,5 CaCl 2, 1,8 MgCl 2 un 25 glikozi 30 minūtes 30,5 grādu temperatūrā ar pastāvīgu burbuļošanu ar 95 procentiem O 2 un 5 procentiem CO 2. Pēc tam Ringera šķīdums tika aizstāts ar līdzīgiem šķīdumiem, bet ar atšķirīgu Cl- (5 mM zemam Cl-, 110 mM normālam Cl-) un K plus koncentrāciju (3 mM normālam K plus, 10 mM augstam K plus). papildu 30 minūtes. Visbeidzot, šķēles tika ātri sasaldētas šķidrā slāpeklī.
StatistikaDivu grupu salīdzināšanai tika izmantots nesapārotā Stjudenta t tests un Velča tests nevienlīdzīgu dispersiju gadījumā (GraphPad Prism, 8. versija.0.2). Vairākkārtējai salīdzināšanai tika veikta vienvirziena vai divvirzienu ANOVA, kam sekoja Tukey vairākkārtējais salīdzināšanas pēctests (GraphPad Prism, 8. versija.{7}}.2). Dati tiek parādīti kā vidējie ± SEM (tabulās un attēlos). Atšķirības tika uzskatītas par būtiskām, ja P <>
PATEICĪBA Autori pateicas Dr Gery Shull (Sinsinati Universitāte, Sinsinaita, OH) par NCC-KO peles nodrošināšanu, Dr Biff Forbush (Jēlas Medicīnas skola, Ņūheivena, CT) par viņa "R5" pNKCC1 antivielu un Dr Henrik Dimke ( Dienviddānijas Universitāte, Odense, Dānija) par viņa peles monoklonālo kopējo NCC antivielu. Autori arī atzīst Monique Carrell un Inger Merete Paulsen par tehnisko palīdzību un Dr Eszter Banki par nodrošināšanunieresparaugi. Kaulu minerālu blīvuma mērījumus un daļu no urīna un plazmas analīzes veica attiecīgi Dr Petra Seebeck un Nadine Nägele (Cīrihes integratīvā grauzēju fizioloģija, Cīrihes Universitāte). Ļoti atzinīgi tika novērtēts Dr. Alicia McDonough (Dienvidkalifornijas Universitāte) un Dr. Olivier Devuyst (Cīrihes Universitāte) ļoti noderīgais ieguldījums.
INTEREŠU KONFLIKTS JL grupa saņem autoratlīdzību par licencētām antivielām pret NCC un fosforilētu Nedd4- 2 attiecīgi no Milipore un Abcam. Abas antivielas pašreizējā pētījumā netika izmantotas. Turklāt JL 2019. gadā saņēma honorāru no VIFOR par mutisku prezentāciju VIFOR organizētajā simpozijā.
