Akūta ādas iedarbība uz ultravioleto gaismu izraisa neitrofilu izraisītu nieru iekaisumu

Mēs un citi esam parādījuši, ka UV gaisma izraisa ātru neitrofilu infiltrāciju ādā (6, 7). Lai gan neitrofīli ir galvenie iekaisuma veicinātāji vietējās traumu vietās, nesen tika atzīts, ka neitrofīli var dzīvot arī orgānos, kas atrodas tālu no primārās iekaisuma vietas (8–10), kur tie veicina plaušu audu bojājumus, veidojot reaktīvo skābekli. sugas (ROS) (11) vai aktivizē adaptīvo imūnsistēmu limfmezglos un kaulu smadzenēs (9, 12). Tiek uzskatīts, ka SLE gadījumā neitrofiliem ir svarīga loma gan lokālās, gan sistēmiskās slimībās. Neitrofīli ir sastopami SLE pacientu ādas bojājumos (13, 14) unnierespacientu ar LN (15, 16). Augsta neitrofilu gēna paraksta ekspresija ir spēcīgs aktīvas slimības, tostarp LN un ādas uzliesmojumu, prognozētājs (17, 18). Proinflammatoriski zema blīvuma granulocīti (LDG) ir palielināti īpaši pacientiem ar ādas slimībām (19). Lai gan šie atklājumi norāda uz neitrofilu lokālo audu bojājumu SLE gadījumā, vai neitrofīli nodrošina patogēnu saikni starp ādas iekaisumu unnieru traumasnav saprotams.

Lai noskaidrotu, kā UV gaismas iedarbība uz ādu ietekmēnieresun neitrofilu lomu šajos procesos, mēs novērtējām izmaiņasnierugēnu ekspresija kopā ar neitrofilu migrāciju. Mēs noskaidrojām, ka akūta ādas pakļaušana UV starojumam stimulē iekaisuma procesusnieres,ieskaitot endotēlija adhēzijas molekulu ekspresiju, iekaisuma mediatorus, traumu marķierus un pārejošu proteīnūriju. Proti, mēs atklājām, ka neitrofīli migrēja uznierespēc UV gaismas iedarbības no IL-17A atkarīgā veidā, lokalizējoties tubulointersticiālajos (TI) apgabalos, kur tiem bija pro-iekaisuma fenotipi. Neitrofilu tirdzniecības bloķēšana ar anti-G-CSF imūnglobulīna (IgG) ārstēšanu ir atceltanieruiekaisumu un novērsa cauruļveida traumu marķieru regulēšanu. Kopā šie atklājumi parāda, ka ādas iedarbība uz UV gaismu izraisa subklīniskunieruiekaisuma un traumu procesi, ko izraisa neitrofīli.

Rezultāti

Ādas pakļaušana UV starojumam izraisa subklīniskus nieru bojājumus.Saules gaismas iedarbība ir saistīta ar sistēmisku simptomu saasināšanos un slimības uzliesmojumu rašanos SLE pacientiem, tostarp nefrītu (2–4). Tāpēc mēs vispirms jautājām, vai akūts sterils ādas iekaisums, ko izraisa vienreizēja ultravioletā B (UVB) gaismas iedarbība (500 mJ/cm2) melnām 6 (B6) pelēm, izraisa izmaiņasnieres, tostarp iekaisumu, ievainojumu un proteīnūriju (1.A attēls). Plaušas tika izvēlētas kā kontroles orgāns, jo SLE gadījumā nav ziņots par saistību starp fotosensitivitāti un klīnisku plaušu slimību. Kopā 500 mJ/cm2 UVB gaismas B6 pelēm ir definētas kā divas minimālas eritematozas devas (20), kas ir atsauces deva, ko izmanto cilvēku protestiem (21). Perfūzijas gēnu ekspresijas analīzesnieres tissues (Fig. 1A) revealed up-regulation in the gene expression of adhesion molecules vcam- 1 and e-selectin on days 1 and 2 after UVB light exposure (Fig. 1 B and C). In contrast, vcam-1 and e-selectin expression demonstrated a downward trend in the lung (SI Appendix, Fig. S1). We also observed a >10-foldnieruindukcija s100A9, neitrofīlā mediatorā, kas saistīts arnieru bojājumi(22), kā arī palielināta s100A6 ekspresija, kalciju saistošs proteīns, kas saistīts ar cauruļveida traumu (23) (1. att. D un E). Kamēr s100A9 indukcija tika konstatēta plaušās, s100A6 gēna ekspresija plaušās nemainījās (SI pielikums, S1 att.). Iekaisuma reakcijanieresbija saistīta arī ar agrīnu il-1 ekspresijas palielināšanos (1. un 2. diena pēc UV), turpretim tnf vai il-6 izmaiņas bija minimālas vai vispār nebija (1. att. F). Il-1 ekspresija plaušās netika konstatēta līdz 6 dienām pēc ādas pakļaušanas UVB gaismai (SI pielikums, S1 att.). Ātra cxcl12 ekspresijas indukcija, kemokīns, ko izdala glomerulos un kanāliņos un ir saistīts arnieru bojājums(24), tika atrasts arīnieresbet ne plaušas (1.G att. un SI pielikums, S1 att.). Tāpēc UVB gaismas izraisīts ādas bojājums ātri izraisanieruproinflammatoriskie procesi, savukārt plaušās novēro mazāk izmaiņu.

Papildus proinflammatoriskajai reakcijai, kas novērotanieres,gan proteīnūrija, gan urīna albumīna/kreatinīna attiecība palielinājās pirmajās dienās pēc UVB gaismas iedarbības uz ādu (1. H un I attēls). Šī straujā ietekme uznieru darbībatika papildināta ar lipokalīna-2 ekspresijas augšupregulāciju unnieru traumas1. molekula (kim-1) (1. att. J un K), cauruļveida marķierinieru bojājumikas tiek novēroti arī LN (25, 26). Neskatoties uz proteīnūrijas pārejošo raksturu, to izpausmenieru traumasmarķieri saglabājās līdz 6. dienai (1. J un K att.), iespējams, atspoguļojot audu atjaunošanos.

UV gaismas izraisīts ādas iekaisums izraisa neitrofilu migrāciju uz nierēm.Lai noskaidrotu, vai neitrofīli piedalās sistēmiskā iekaisuma reakcijā uz UVB gaismu, mēs pētījām neitrofilu uzkrāšanās kinētiku UV gaismas apstarotā ādā, kā arī liesā,nieres,un C57BL/6 J (B6) peļu plaušas, celms, kas vislabāk atdarina ādas izmaiņas UVB gaismā cilvēka ādā (2.A attēls) (27). Pēc akūtas UVB gaismas iedarbības uz ādu neitrofilo leikocītu skaits ādā palielinājās septiņas reizes 24 stundu laikā un saglabājās paaugstināts 6 dienas, salīdzinot ar sākotnējo līmeni pirms UV starojuma (D-1) ​​(2.B attēls). Tam sekoja neitrofilo leikocītu skaita samazināšanās kaulu smadzenēs un cirkulējošo neitrofilo leikocītu skaita palielināšanās piecas reizes no 1. līdz 6. dienai (2. att. C un D). Interesanti, ka tajā pašā laika posmā neitrofilu skaits palielinājās liesā, plaušās unnieres(2. att. E–G un SI pielikums, att. S2A). Precīza kinētika dažādos orgānos bija atšķirīga, sasniedzot maksimumu 1. dienā plaušās un 2. līdz 6. dienā.nieresun liesa (2. att. E–G). Iekšnieres, neitrofīli pārsvarā lokalizēti tubulointersticiālajā zonā, ieskaitot asinsvadus, par ko liecina neitrofilo elastāzes (NE) krāsojums trombocītu/endotēlija šūnu adhēzijas molekulas -1 (PECAM-1/CD31) tuvumā vai kolokalizēta ar to. ) (2H attēls). Reprezentatīvajos attēlos 2. H attēlā ir redzami neitrofīli intersticiālajā asinsvadā vai ap to (pilnīgi baltas bultiņas) un intersticiumā (baltas punktētas bultiņas), un neregulāri neitrofīli, kas atrodami arī glomerulos (dzeltenas bultiņas). Līdzīga lokalizācija tika konstatēta ar anti-Ly6G imūnfluorescences (IF) krāsošanu (SI pielikums, S2B att.).

Lai noteiktu, vai citām iedzimtajām imūno šūnām bija lokālas un sistēmiskas reakcijas, kas līdzīgas neitrofiliem, mēs pārbaudījām monocītu (CD11b plus Ly6C plus Ly6G−) sadalījumu tajos pašos laika punktos pēc UVB gaismas iedarbības. Kaut arī ādā tika iekļauti arī monocīti, ādā tika atklāts tikai neliels skaits infiltrējošu monocītu.nieres6. dienā pēc UVB iedarbības (apmēram 2-kārtīgi, salīdzinot ar ∼ 105-kārtīgu pieaugumunieresneitrofīli) (2. att. F un SI pielikuma att., S3). Netika konstatēts monocītu skaita pieaugums plaušās vai liesā (SI pielikums, S3 att.), kas liecina, ka sistēmiskā reakcija uz UV traumu bija salīdzinoši selektīva attiecībā uz neitrofiliem.

Neitrofilu infiltrāciju ādā pavadīja histoloģiskas izmaiņas, tostarp agrīns dermas iekaisums un epidermas šūnu nāve (1. un 2. diena), kam sekoja akantozes un hiperkeratozes attīstība ar serocelulāras garozas veidošanos dažos gadījumos (6. diena) (SI pielikums, S4 att.). Konkrēti, pēc UVB gaismas iedarbības neparādījās atklāti ādas bojājumi, kas liecina, ka novērotā imūnšūnu infiltrācija notika sterilos apstākļos, lai gan nevar izslēgt izmainīta ādas mikrobioma ieguldījumu (20).

Kopā šie atklājumi parāda, ka vienas UVB gaismas devas iedarbība uz ādu mobilizē neitrofilus gan vietējā iekaisuma vietā, gan iekšējos orgānos, tostarpnieres,ko pavada asins neitrofilija. Lai gan kopējie migrācijas modeļi bija līdzīgi gan peļu tēviņiem, gan mātītēm, mātītēm neitrofilo leikocītu infiltrācija ādā bija ātrāka nekā tēviņiem (2.B att.). Turpretim epidermas ievainojums ar lentes noņemšanu neizraisīja neitrofilu migrāciju uznieresneskatoties uz līdzīgu neitrofilo leikocītu infiltrācijas un iekaisuma reakcijas un audu bojājumu līmeni, kāds redzams UV gaismas iedarbības gadījumā (SI pielikums, S5. att.), kas norāda, ka sistēmiskā neitrofilo leikocītu izplatība nav raksturīga visiem sterilu ādas bojājumu veidiem.

CISTANCHE UZLABOS NIERU/NIeru SLIMĪBU

IL-17A veicina neitrofilo leikocītu atjaunošanos pēc UV gaismas iedarbības uz ādu.Ķīmotaktisko un iekaisuma mediatoru apsekojums ādā atklāja būtisku neitrofilu ķīmokīnu un iekaisuma citokīnu cxcl1, cxcl5/6, g-csf un il-1 1 gēnu ekspresijas regulēšanu līdz 2 dienām pēc UV iedarbības (att. 3 A–D). Straujais un noturīgais s100A9 ekspresijas pieaugums atbilda neitrofilu infiltrācijas ādā kinētikai (2.B att. un SI pielikums, S6. att.), savukārt citokīni il-6, tnf un il-33 tika īslaicīgi palielināti un atgriezās sākotnējā izteiksmē līdz 6. dienai (SI pielikums, S6. att.). Turpretim il-36a bija paaugstināts tikai 6. dienā (SI pielikums, S6. attēls), iespējams, atspoguļojot reparatīvo funkciju. Pārejoša (1 līdz 2 dienas) monocītu klātbūtne ādā (SI pielikums, S3 att.) bija paralēla monocītiem raksturīgo chemokīnu ccl4 un ccl2 (SI pielikums, S6 att.) regulēšanai. Līdzīgi kā neitrofilu uzkrāšanās peļu mātīšu ādā (2.B att.), arī mātītēm monocītu uzkrāšanās ādā notika agrāk nekā tēviņiem (SI pielikums, S3 att.).

UV skin exposure was accompanied by rapid (6 h) 12-fold induction in il-17a gene expression in the skin (Fig. 3E) as well as >1,000-kārtīga ādas indukcija g-csf ekspresijā 1. un 2. dienā pēc UV starojuma (3. C attēls). Lai noteiktu, vai šo citokīnu indukcija bija saistīta ar neitrofilu mobilizāciju, mēs vispirms kvantitatīvi noteicām citokīnu proteīnu koncentrāciju asinīs, kas atklāja spēcīgu un ilgstošu (10- līdz 100- reizes) plazmas koncentrācijas pieaugumu. IL-17A 6 līdz 24 stundas pēc UV gaismas iedarbības (3.F att.) kopā ar pārejošu (maksimums pēc 6 stundām) IL-6 un IL-12, citokīnu, kas var būt lejpus IL-17A (28) (3. att. G un H). Netika novērota IFN, GM-CSF, TNF, IL-10, IL-27, IL-23 vai IL1 koncentrācijas palielināšanās plazmā. Lai noteiktu, vai IL-17A ir nepieciešams UVB izraisītu neitrofilu piesaistīšanai, mēs bloķējām IL-17A iedarbību ar neitralizējošu antivielu pirms UV iedarbības (3. attēls). Anti-IL-17A IgG ievērojami mazināja asins neitrofīliju (3.J att.) un neitrofilo leikocītu pieplūdumu gan atklātajos ādas audos (3.K. att. un SI pielikums, S7A att.), gannieres(3L att. un SI pielikums, S7B att.). Šie atklājumi liecina, ka neitrofilu rekrutāciju, reaģējot uz UV gaismu, vismaz daļēji veicina IL-17A.

Neitrofīli veicina nieru iekaisumu pēc UV iedarbības uz āduGaisma.Lai noteiktu, vai neitrofīli ir atbildīgi par iekaisuma izmaiņāmnieres following skin UVB light exposure, we blocked neutrophil recruitment prior to UV light exposure. Since cutaneous g-csf expression was up-regulated >1,000-reizes pēc UV iedarbības, kas liecina par G-CSF ķīmijtaktisko lomu neitrofilu piesaistē, reaģējot uz UV gaismu, mēs kavējām neitrofilu mobilizāciju no kaulu smadzenēm, bloķējot G-CSF, kā norādīts 4.A attēlā. G-CSF neitralizēšana novērsa asins neitrofīliju, kā arī neitrofilu piesaistinierespēc UVB gaismas iedarbības uz ādu (4. B un C att.). Proti, kā iepriekš ziņots dažādos modeļos (29, 30), G-CSF bloķēšana nemainīja monocītu skaitunieres(4. D attēls). Samazināta neitrofilu migrācija uznierestika pavadīts ievērojams samazinājumsnieruadhēzijas molekulu vcam-1 un e-selektīna (4. att. E un F), kā arī iekaisuma mediatoru s100A9 un il-1 1 d ekspresiju pēc UVB iedarbības (4. att. G un H). Turklāt audu bojājumu marķieri lipokalīns-2 un kim-1nieresbija ievērojami samazinātas pelēm, kuras tika pakļautas UV gaismai, un kuras tika ārstētas ar G-CSF bloķējošu antivielu, salīdzinot ar dzīvniekiem, kas tika pakļauti UV iedarbībai (4. I un J att.). Kā mēs ziņojām iepriekš (6), akūta ādas iedarbība uz UVB gaismu izraisīja I tipa interferona reakcijunieres(4K att.). G-CSF bloķēšana ievērojami samazināja, bet pilnībā neatcēla IFN punktu skaitu (4K. attēls). Kamēr neitrofilu klātbūtnenieresbija nepieciešama akūtām iekaisuma un traumu reakcijām, kas novērotas 1 dienu pēc ādas UV starojuma iedarbības (4. att.), šajā laika posmā proteīnūrijas atšķirības netika novērotas, jo proteīnūrijas maksimums notika aptuveni 4. dienā pēc UV iedarbības (1. att. I). Kopā šie dati liecina, ka neitrofīli ir atbildīgi par iekaisuma reakciju un tieši vai netieši veicina I tipa interferona indukciju organismā.nierespēc UV gaismas iedarbības uz ādu. Līdzīgi rezultātiem, kas iegūti ar anti-G-CSF IgG, neitralizējošu anti-IL-17 antivielu ievadīšana daļēji nomāca neitrofilu migrāciju uznieresun izraisīja samazinātu gēnu ekspresijunieresiekaisuma (vcam-1 un s100A9) un traumu marķieriem (lipokalīns-2 un kim-1), lai gan statistiski nozīmīgs bija tikai kim-1 izteiksmes samazinājums (SI pielikums, att. . S7 C–F)

Nieru neitrofilu apakšpopulācija tiek pārvietota reversā veidā, fenotips ir konstatēts arī SLE pacientu asinīs.Lai gan jau sen ir pieņemts, ka neitrofīli, kas nonāk infekcijas vai sterila iekaisuma vietās, pēc tam tiek pakļauti apoptozei un makrofāgi tos ātri izvada, vairāki pētījumi atklāja, ka daži neitrofīli pārvietojas divvirzienu veidā, tas ir, pēc iekļūšanas audos tie migrē. Atgriezties asinsritē un iefiltrēties citā vietā, process tiek dēvēts par reverso transmigrāciju (rTEM) (8, 10, 11, 31–34). Lai izpētītu, vai neitrofīli, kas atrodas uznierespēc ādas pakļaušanas UVB gaismai, kas šķērsoja pakļauto ādu, mēs pētījām neitrofilu migrāciju fotoaktivējamā B6 peles modelī (cilvēka ubikvitīna C [UBC] fotoaktivēts [PA]-zaļais fluorescējošais proteīns [GFP]).

Eksperimentālā shēma ir parādīta 5.A attēlā; 1 d pēc ādas iedarbības ar vienu UVB gaismas devu, āda tika pakļauta violetai gaismai (405 nm) tā, ka infiltrējošās imūnās šūnas tika fotokonvertētas par GFP pozitīvām šūnām. Fotokonvertētie neitrofīli (GFP plus Ly6G plus) pēc tam tika kvantificēti perfūzānieresnākošajā dienā. Plūsmas citometrijas analīze atklāja, ka aptuveni 20 procenti nierēs infiltrējošo neitrofilu bija GFP pozitīvi pēc fona signāla atņemšanas (∼10 procenti) (5.B attēls). Atšķirībā no sterila iekaisuma modeļiem aknās vai kremasra muskuļos (8, 10), mēs neatklājām fotokonvertētus neitrofilus plaušās, iespējams, tāpēc, ka 2. dienā plaušās tika atrasts maz neitrofilu (2. att. F). Lai pārbaudītu, vai GFP plus neitrofīlinieresekstravazēts no UV iedarbībai pakļautiem ādas audiem vai intravaskulāri PA, mēs salīdzinājām GFP un neitrofilu skaita izmaiņas, kas iegūtas nonierespeļu, kurām tā pati āda, kas tika pakļauta UV gaismai, bija PA ar violetu gaismu dienu vēlāk (I grupa), salīdzinot ar pelēm, kurām āda, kas atrodas blakus šai UV gaismas iedarbībai, dienu vēlāk bija PA ar violetu gaismu (II grupa, diagramma SI pielikumā, S8A att.). Lai gan starp grupām cirkulējošo neitrofilu procentuālais daudzums neatšķīrās (SI pielikums, S8B att.), lielāks GFP plus neitrofilu pieaugums tika novērotsnierespelēm, kurām UV iedarbībai pakļauta āda bija arī PA (I grupa), salīdzinot ar GFP plus neitrofilu palielinājuma trūkumu pelēm, kurām āda, kas nav pakļauta UV starojumam, bija PA (II grupa) (SI pielikums, S7B att.). II grupā neitrofilo leikocītu skaits bija līdzīgs GFP pozitivitātes fonam, kas redzams 5.B attēlā (SI pielikums, S8B attēls).

Kamēr zems GFP plus līmenisnieresneitrofīli II grupā liecināja, ka violetā gaisma nepadara PA cirkulējošās šūnas ādā, kas nav pakļauta UV iedarbībai, joprojām bija iespējams, ka UV gaismas iedarbība mainīja neitrofilu mijiedarbību ar ādas asinsvadiem, nodrošinot lielāku fotokonversiju un sekojošu.nierespiekļuvi. Lai noteiktu TEM neitrofilu relatīvās proporcijas, mēs kvantitatīvi noteicām virsmas marķieru ekspresiju, ko izmantoja, lai raksturotu neitrofilus, kuriem tika veikta rTEM: CXCR4hi (8) un ICAM1hiCXCR1lo (11, 35). Patiešām, GFP plusnieresneitrofīli izteica augstāku CXCR4 līmeni, salīdzinot ar GFP plus neitrofiliem ādā vai GFP- neitrofiliem ādā.nieres(5.C att.). No

interese,nieruCXCR4 liganda cxcl12 ekspresija 1 līdz 2 dienas pēc UVB gaismas iedarbības uz ādu notika vienlaikus ar CXCR4hi neitrofilu klātbūtni organismā.nieres(1. G att.), iespējams, nodrošinot ķīmijtaktisko stimulu šo neitrofilu piesaistīšanai nierēs. Interesanti, ka mēs atklājām CXCR4hi un ICAM1- hiCXCR1lo neitrofilus kaulu smadzenēs vēlu pēc UV iedarbības (6. diena, SI pielikums, S9 B un C att.), kas liecina, ka daži no šiem neitrofīliem arī atgriezās kaulu smadzenēs, kas ir līdzīgas tām, par kurām ziņots par rTEM pēc aknu bojājuma vai ādas vīrusu infekcijas (12, 36). Saskaņā ar šiem novērojumiem mēs atklājām augstāku CXCR4 ekspresiju uz asins neitrofiliem 2. dienā pēc UV iedarbības, iespējams, satverot šūnas ceļā uznieresun kaulu smadzenes (SI pielikums, S9D att.). Tāpat ievērojami lielāks ICAM1hiCXCR1lo šūnu procentuālais daudzums tika atklāts starp GFP plus neitrofiliemnieressalīdzinot ar GFP plus neitrofiliem ādā un GFP- neitrofiliem ādānieres(5. D attēls). ICAM1hiCXCR1lo fenotips tika atklāts aptuveni 20 līdz 35 procentiem no GFP plus neitrofiliemnieres(5D att.), kas liecina, ka neitrofilu apakškopa, kas migrē uznierescaur UV starojuma iedarbībai pakļautu ādu to dara ar reverso transmigrāciju, bet pārējā daļanieresneitrofīli, visticamāk, tiek aktivizēti, cirkulējot caur iekaisušo UV starojuma iedarbībai pakļauto ādu. ICAM1- hiCXCR1lo neitrofilu apakšpopulācija tika konstatēta arīnieresparasto B6 pelēm, kas pakļautas UV gaismai, kuras nesaņēma PA (SI pielikums, S9A att.).

Lai gan gan CXCR4hi, gan ICAM1hiCXCR1lo neitrofilu fenotipi ir saistīti ar iekaisuma funkcijām un audu bojājumiem dažādos peļu modeļos (11, 31, 37), ar šīm šūnu populācijām cilvēku slimībās ir veikti daži pētījumi. Ņemot vērā neitrofilu jauno lomu SLE (13, 17, 18) un to šķietamo neviendabīgumu (19), mēs pētījām, vai SLE pacientiem ir normāla blīvuma polimorfonukleārās šūnas (PMN) vai LDG.

demonstrēja reversās migrācijas fenotipus: CXCR4hi (37, 38) un ICAM1hiCXCR1lo. PMN un LDG plūsmas citometrijas profilēšana atklāja augstāku CXCR4 ekspresiju uz šo šūnu virsmas SLE pacientiem, salīdzinot ar veselām kontrolēm (6. A un C att.). Turklāt mēs atklājām nelielu, bet ievērojami lielāku ICAM1hiCXCR1lo PMN procentuālo daudzumu SLE asinīs (vidēji 3,5 procenti), salīdzinot ar veselām kontrolēm (vidēji 1,4 procenti) (6.B attēls). Interesanti, ka LDG neitrofilu populācijā (CD15 plus CD14loCD10 plus perifēro asiņu mononukleārajās šūnās [PBMC]) bija lielāks ICAM1hiCXCR1lo šūnu procentuālais daudzums nekā PMN gan veselās (vidēji 7,1 procenti), gan SLE asinīs (vidēji 29,4 procenti) 6 B un D). RTEM līdzīgā populācija bija ievērojami vairāk pārstāvēta SLE pacientu LDG, salīdzinot ar veselām kontrolēm (6. D attēls). Šie dati identificē rTEM līdzīgu neitrofilu fenotipu klātbūtni PMN un īpaši LDG SLE pacientiem.

Diskusija

UV gaismas iedarbības uz ādu sistēmiskā ietekme ir slikti izprotama. Šo ceļu identificēšana normālos sākuma apstākļos var informēt par sistēmiskās audu iesaistīšanās mehānismiem pēc saules iedarbības, kas rodas tādās slimībās kā SLE (2–4). Šeit mēs ziņojam par vairākiem atklājumiem par to, kā saules gaismas iedarbība ietekmē nieres. Pirmkārt, mēs parādījām, ka akūta ādas iedarbība uz UVB gaismu izraisa iekaisuma un traumu reakcijasnieres,ieskaitot subklīnisku proteīnūriju. Interesanti, ka šienieruizmaiņas tika pavadītas ar neitrofilu infiltrāciju nierēs pēc UVB gaismas izraisīta ādas iekaisuma. Neitrofilu atbildes reakcija bija atkarīga no IL-17A un G-CSF. Neitrofiliem nierēs bija proinflammatoriski fenotipi, par ko liecina NE ārpusšūnu lokalizācija, lielāka rTEM (CXCR4hi) daļa, kas pazīstama arī kā "novecojušas" un ICAM1hiCXCR1lo šūnas. Neitrofīli bija tieši saistīti ar subklīniskunieru traumas,jo neitrofilu samazināšanās izraisīja ievērojamu adhēzijas molekulu, iekaisuma citokīnu, IFN-I paraksta un nieru bojājumu marķieru ekspresijas samazināšanos pēc ādas UV iedarbības.

Ir ziņots, ka citi ādas ievainojumu veidi, piemēram, lentes noņemšana un lokāla TLR7 agonista lietošana, uzlabonieru traumasdažos lupus modeļos, lai gan tika uzskatīts, ka slimības pastiprināšanos veicina makrofāgi un dendrītiskās šūnas, nevis neitrofīli (39, 40). Pierādot, ka lentes noņemšana neizraisīja neitrofilu piesaistinieres, mēs ierosinām, ka UV gaismas iedarbība atšķiras no cita veida sterila ādas iekaisuma. To var izskaidrot ar fotoproduktu vai unikālu iekaisuma mediatoru rašanos pēc UV traumas, kas sagatavo nieres iekaisumam, ar atšķirībām neitrofilu noņemšanā pēc UV, salīdzinot ar lentes noņemšanu, vai ar citiem faktoriem. Mēs novērojām, ka UV gaisma izraisīja ātru un spēcīgu il-17ziņneša RNS (mRNS) indukciju ādā kopā ar augstu cirkulējošā IL-17A proteīna līmeni (apmēram 100-kārtīgu pieaugumu). , kas bija nepieciešama neitrofilu piesaistīšanai pēc UV gaismas iedarbības. Vienlaicīga 100- līdz 1,000- reizes indukcija ādas g-csf izteiksmē liecina, ka IL-17A/G-CSF ass ir iespējamais mehānisms, kas ir atbildīgs par neitrofīliju un neitrofilo audu lokalizāciju. reaģējot uz UV gaismu. IL-17A loma granulopoēzes un neitrofilo leikocītu skaita regulēšanā, inducējot G-CSF, ir labi zināma homeostatiskos apstākļos, un dažos pētījumos ir konstatēts, ka IL-17A ir svarīga neitrofilo leikocītu skaita palielināšanās vietās. sterils iekaisums (41, 42). Lupus gadījumā paaugstināta IL-17A ekspresija tiek konstatēta ādas bojājumos (43), un paaugstināts cirkulējošā IL-17A līmenis ir saistīts ar sliktākām slimības izpausmēm (44), lai gan specifiskā saistība ar neitrofiliem, šīs slimības patogēna populācija (13, 17, 18), joprojām nav izpētīta. Papildus tiešajai ietekmei uz G-CSF mediētu neitrofilu mobilizāciju no kaulu smadzenēm, IL- 17A var arī veicināt neitrofilu pārvietošanos uz kaulu smadzenēm.nieresstimulējot adhēzijas molekulu (piem., VCAM-1 un E-Selectin) ekspresiju uznieruendotēlijs (45, 46).

Izmantojot to pašu akūtās UV iedarbības modeli, mēs nesen ziņojām, ka viena UV gaismas deva izraisīja lokālu un sistēmisku IFN-I reakciju, kas bija nepieciešama efektīvai neitrofilu piesaistīšanai ādā (6). Tā kā ir pierādīts, ka IFN-I inducē IL-17A veidošanos (47), ir ticams, ka šie ceļi neatkarīgi vai kopā noved pie UV gaismas izraisītas neitrofilu piesaistes un migrācijas, par ko mēs ziņojam šeit. Lai gan mūsu atklājumi liecina par IL- 17A iekaisuma lomu, UVB gaismas nomācošā ietekme uz IL-17A signāliem jau iepriekš tika ziņots psoriāzes gadījumā, kad psoriātiskās ādas pakļaušana UVB gaismas iedarbībai likvidēja patogēnās T šūnas un mieloīdo iekaisuma dendru šūnas (48, 49). Tā kā psoriātiskā āda, atšķirībā no veselas, ir bagāta ar IL-17 producējošām un reaģējošām T šūnām, šūnu sastāva atšķirības, visticamāk, noteiks reakciju uz UVB gaismu, tostarp UVB gaismas izraisītās IL nomākšanas pakāpi. -17Receptora izteiksme (50). UV deva var arī noteikt, vai rodas iekaisuma vai terapeitiskais efekts: zemas devas ir saistītas ar pretiekaisuma un imūnsupresīvām sekām (51), iespējams, inhibējot CD8 T šūnu atbildes reakcijas (52).

Audu iekaisuma laikā neitrofīliem ir vairākas lomas. Ja tos aktivizē ar patogēniem saistītie molekulārie modeļi un ar bojājumiem saistīti molekulārie modeļi (DAMPS) vai receptoru iesaistīšanās, neitrofīli tieši veicina audu bojājumus, atbrīvojot proteāzes, ROS un neitrofilu ekstracelulāro slazdu (NET) ekstrūzijas (53, 54). Neitrofīli var arī veicināt audu atjaunošanos, veicot šūnu atlieku fagocitozi un nodrošinot audu revaskularizāciju (8). SLE gadījumā neitrofilu gēna paraksts ir spēcīgs aktīvas slimības, tostarp LN un ādas vilkēdes, prognozētājs (17, 18). Neitrofīli ir atrodami ādas bojājumos (13, 14), kā arīnieresSLE pacientu biopsijas paraugi (15, 16), un to iekaisuma īpašības daļēji ir saistītas ar NET veidošanos (16). Šis process ietver palielinātu ROS ražošanu (55), mitohondriju DNS izdalīšanos (55) un iekaisuma proteīnu, piemēram, s100A9 (56), IL-1b (57) un I tipa interferonu (55), izdalīšanos un indukciju. , 58). Mūsu atklājumi, ka neitrofilu migrācijas uz nierēm kavēšana atcēla s100A9 un ievērojami samazināja IL-1b ekspresiju unnieresIFN rādītājs liecina, ka varētu būt līdzīgas iekaisuma funkcijas. Kas attiecas uz nieru slimību SLE gadījumā, neitrofīli galvenokārt lokalizēti TI endotēlijā, kas ir palielinātas ekspresijas vietā.nieru traumasmarķieri kim-1 un lipokalīns-2 LN nieru audos (59,60). Proteīnūrija var rasties pārmērīgas glomerulārās barjeras proteīnu caurlaidības dēļ, ko izraisa traucēta proteīna reabsorbcija kanāliņos vai šo mehānismu kombinācija (61). TI traumas SLE pacientiem ir bieža patoloģiska atrade LN nierēs, tostarp tiem, kuriem ir viegls glomerulārais bojājums (61, 62). Ir pierādīts, ka TI trauma paredz LN smagumu (63, 64), tomēr mehānismi, kas to izraisa, nav zināmi. Tā kā paaugstināts kim-1 un lipokalīns-2 ir atzīti TI traumas marķieri SLE gadījumā (26, 65) un bloķē neitrofilu migrāciju uzniereskavēja to ekspresiju, mēs ierosinām, ka pārejoša proteīnūrija, kas novērota pēc UV iedarbības, ir neitrofilu izraisīta subklīniska TI iekaisuma sekas (65). Paaugstināta nieru vcam-1 izteiksme, kas ir vēl viens TI traumas marķieris SLE gadījumā (66), vēl vairāk atbalsta šo modeli.

Ir pierādīts, ka neitrofīli ne tikai izplata iekaisumu vietējās sterilu vai infekciozu traumu vietās, bet arī atrodas attālos orgānos (8–10), kur atkarībā no konteksta tie veicina audu bojājumus, veidojot ROS (11) vai aktivizējas. adaptīvā imūnsistēma limfmezglos un kaulu smadzenēs (9, 12). Šo neitrofilu iekaisuma raksturs ir saistīts ar to spēju izkļūt no primārās traumas vietas un migrēt uz sekundārajām vietām, tas ir, iziet rTEM (9–11, 31–34). Mūsu atklājumi, ka GFP saturošo šūnu PA ādā pēc UV iedarbības izraisīja GFP plus neitrofilu noteikšanunieresar rTEM fenotipu liecina, ka apakšpopulācijanieruneitrofīli apgriezti migrēja no ādas, kas pakļauta UV starojumam (GFP plus neitrofīli veido aptuveni 20 procentus nonieresneitrofīli un no tiem 20 līdz 35 procenti ir rTEM; tāpēc rTEM veido 4 līdz 7 procentus no kopējā apjomanieresneitrofīli). Šī rTEM proporcija ir salīdzināma ar īpatsvaru, kas ziņots pēc sterila aknu bojājuma (∼9 procenti) (36) un išēmijas-reperfūzijas traumas (∼8 procenti) (11). Ir pierādīts, ka citos apstākļos rTEM ir pro-iekaisuma (10, 11) un tiem ir pavājināta apoptoze (35), kā rezultātā pastāv iespēja, ka tiem ir nozīme UV inducētās.nieru traumas.Paaugstināta CXCR4 ekspresija uz šiem neitrofiliem ir īpaši nozīmīga kā sakritībanieruTika novērota cxcl12, CXCR4 liganda, ko ekspresē podocīti un kanāliņi (24), ekspresija, kas, iespējams, nodrošina ķīmijtaktisko signālu šai neitrofilu populācijai. Paaugstināta CXCR4 ekspresija imūnās šūnās kopā ar augstu līmeninieruCXCL12 ir identificēti SLE pacientiem ar LN (67), un šis ceļš bija saistīts ar vilkēdi, kā arī išēmiju-reperfūzijunieru traumaspelēm (24, 68). Papildus tam, ka tas ir rTEM marķieris, palielināta CXCR4 ekspresija ir arī "novecojošu" neitrofilu indikators, kas var būt starpnieks audus bojājošas iekaisuma reakcijas (38). Precīza CXCR4 loma neitrofilu piesaistēnieresvar izpētīt ar CXCR4 antagonismu, kā tas iepriekš tika darīts citos sterila ievainojuma modeļos (38).

Audiem specifiskā neitrofilu migrācija un mehānismi, kas ir atbildīgi par adhēzijas molekulu atšķirīgu ekspresiju dažādos orgānos, nav labi saprotami (69). Augstāks ķīmokīna cxcl12 ekspresijas līmenisnieresbet ne plaušas varētu izskaidrot CXCR4hi neitrofilu primāro klātbūtni nierēs. Turklāt vcam-1 un e-selektīna ekspresijas indukcija nierēs, salīdzinot ar ekspresijas izmaiņu neesamību plaušās, iespējams, veicina preferenciālu neitrofilo leikocītu piesaisti un aizturi nierēs. S100A9 ekspresijas palielināšanās plaušās no 5- līdz 6-kārtīgi, salīdzinot ar 30- līdz 60-kārtīgu palielināšanos nierēs, kā arī 6-kārtīgu pieaugumu il-1b ekspresija plaušās salīdzinājumā ar 16-kārtīgu palielināšanos nierēs vēl vairāk norāda uz audu atšķirībām iekaisuma reakcijā. Neitrofilo leikocītu infiltrācijas samazināšanos nierēs pēc G-CSF neitralizācijas var saistīt gan ar cirkulējošā skaita samazināšanos un neitrofilu aktivāciju, gan vcam{13}} un e-selektīna lokālās ekspresijas samazināšanos. Tomēr mēs nevaram būt droši, vai šo adhēzijas molekulu sākotnējā regulēšana pēc ādas UV iedarbības ir saistīta ar no ādas iegūtiem citokīniem/DAMPS, vai arī neitrofīli, izdalot serīna proteāzes, tieši veicina to ekspresiju, kā parādīts citos pētījumos. konteksti (70). Neatkarīgi no mehānismiem un atzīmējot, ka mēs neesam veikuši visaptverošu visu audu analīzi, mūsu pētījumi sniedz pierādījumus par orgānu selektivitāti UV gaismas mediētās sistēmiskās iedarbības jomā. Turpmākajos pētījumos tiks aplūkotas sistēmiskas neitrofilu izplatīšanās audiem specifiskās funkcionālās sekas, piemēram, asinsvadu albumīna noplūdes un tūskas veidošanās plaušās (11, 36).

Pacientiem ar SLE ir grūti nepārprotami saistīt ādas UV gaismas iedarbību ar sistēmiskas slimības saasinājumiem, jo ​​ir ievērojamas atšķirības (1 līdz 3 nedēļas) redzamās fotosensitivitātes reakcijas dažādiem indivīdiem (21). Turklāt subklīniskānieru traumasvar viegli palaist garām, līdz sekas tiek apvienotas secīgai UV gaismas iedarbībai. Kamēr mēs atklājām, ka tas ir saistīts ar neitrofilu starpniecībunieru iekaisumsreaģējot uz UV gaismu, neizraisa klīnisku slimību veselām pelēm, šāds mehānisms var veicināt LN uzliesmojumus gaismjutīgiem sarkanās vilkēdes pacientiem vairākos veidos. Fc receptoru iesaistīšanās imūnkompleksu ietekmē varētu veicināt neitrofilu piesaisti, izraisot ROS un proteāzes izdalīšanos (71); palielināta lupus neitrofilu un LDG spēja ražot NET, kas SLE pacientiem netiek efektīvi iztīrīti (72), var izraisīt audus bojājošu proteāžu izdalīšanos (73), IFN-I atbildes reakcijas izplatīšanos (58) , vai tiešiem bojājumiemnieresendotēlijs, radot asinsvadu bojājumus un noplūdes (16). Turklāt lupus ādas pamatā esošās atšķirības, piemēram, pastiprināta IFN-I signalizācija (5, 74) un aizsargājošās Langerhansa šūnu populācijas defekti (75), varētu informēt par neitrofilu izraisīto sistēmisko reakciju apjomu un raksturu. Neitrofilu migrācijas izsekošanu kopā ar autoantivielu nopratināšanu, apoptotisko šūnu uzkrāšanos un zemu komplementa līmeni var risināt, izmantojot jaunus vilkēdes modeļus, piemēram, ģenētiski definētus trīskāršos mutantus (Sle1.Mfge8−/− C1q−/− un Sle1.Mfge8−). /−C3−/−) (76) vai citi sarkanās vilkēdes celmi pēc UV gaismas iedarbības.

Turklāt precīzus mehānismus, kas saista neitrofilus ar iekaisumu SLE gadījumā, var ietekmēt neitrofilu/LDG fenotips, jo ir kļuvusi skaidrāka šo populāciju neviendabīgums (77). Mūsu konstatējumi par paaugstinātu CXCR4 un ICAM1hiCXCR1lo (rTEM) cirkulējošo populāciju, īpaši SLE LDG, vēl vairāk palielina šo neviendabīgumu un liecina, ka dažiem no vairāk iekaisuma granulocītiem asinīs varētu būt iepriekšēja "audiu pieredze", tas ir, uzturēšanās skartie orgānu audi, piemēram, āda, pirms sistēmiskas izplatīšanās. Par rTEM fenotipiem iepriekš ziņots reimatoīdā artrīta pacientu sinoviālajā šķidrumā un cirkulējošajos neitrofilos (35, 78) un ar akūtu pankreatītu saistītu plaušu bojājumu gadījumā (79). Viņu loma SLE prasa turpmāku izmeklēšanu.

CISTANČE UZLABOS NIERU/NIERES SĀPES

Materiāli un metodes

Peles.Visus eksperimentus ar dzīvniekiem apstiprināja Vašingtonas Universitātes Sietlas Institucionālā dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja. Sākotnējie eksperimenti tika veikti, izmantojot gan vīriešu, gan mātīšu C57BL/6J peles (Jackson Laboratory, 3 līdz 4 mēnešus vecas, 1. un 2. att.). Visos turpmākajos eksperimentos tika izmantotas peļu mātītes. PA pētījumi tika veikti ar B6. Cg-Ptprc Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J peļu mātītes (Jackson Laboratory, 3–4 mēn vecas). Šīs peles tika izveidotas, ievadot transgēnu vektoru, kas satur PAGFP (T203H variants), cilvēka ubikvitīna C promotora transkripcijas kontrolē C57BL / 6 embrijos. Dzīvnieki tika izmitināti no patogēniem brīvos apstākļos un tika turēti 12 stundu gaismas-tumsas ciklos ar ad libitum piekļuvi pārtikai un ūdenim. Eksperimenti ar visiem dzīvniekiem tika veikti vienā un tajā pašā diennakts laikā, lai izvairītos no diennakts ritma ietekmes uz neitrofilu migrāciju (38).

UVB gaismas iedarbība un lentes noņemšana.C57BL/6 peļu tēviņu un mātīšu muguras aspekts tika noskūts vismaz 24 stundas pirms apstarošanas ar UVB gaismu, un eksperimentos tika izmantotas tikai peles ar nepigmentētu ādu. Peles tika anestēzētas ar izoflurānu un pakļautas vienai UVB gaismas devai (500 mJ/cm2), izmantojot FS40T12/UVB spuldzes (National Biological Corporation), ar maksimālo emisiju no 300 līdz 315 nm. UVB gaismas enerģija pie muguras virsmas tika mērīta ar Photo light IL1400A radiometru, kas aprīkots ar SEL240/UVB detektoru (International Light Technologies). Peles tika eitanāzētas 1, 2 vai 6 dienas pēc UVB gaismas iedarbības, un peles, kas nebija apstarotas, tika izmantotas kā kontroles (D-1) (2. att.). Epidermas lentes noņemšana tika veikta, kā aprakstīts iepriekš (7), un ādas unnierestika novērtēti 24 stundas pēc traumas

IL-17A un G-CSF inhibīcija.Peles tika ārstētas intravenozi ar 100 ug attīrītu žurku anti-peļu IL-17A IgG (BioLegend) vai izotipa kontroli 3 stundas pirms UV gaismas (1 × 500 mJ/cm2) (3. att.). Neitrofilu klātbūtne asinīs, ādā un ar fizioloģisko šķīdumunieresaudi tika novērtēti ar plūsmas citometriju 24 stundas pēc UV iedarbības, kā aprakstīts tālāk. Neitrofilu migrācija, reaģējot uz UV gaismu, tika kavēta, ārstējot peles intraperitoneāli ar 50 ug anti-peles G-CSF monoklonālo antivielu vai peles IgG izotipa kontroli (R&D Systems) 24 stundas un 3 stundas pirms ādas pakļaušanas UVB gaismai (1 × 500 mJ). /cm2) (4.A att.). Pēc sirds perfūzijas neitrofilo leikocītu un monocītu skaitsnierestika novērtēti ar plūsmas citometriju un gēnu ekspresiju ar qPCR, kā aprakstīts tālāk. Peles, kas nebija pakļautas UVB gaismai, tika izmantotas kā papildu kontroles grupa.

Šūnu izolēšana no dažādiem orgāniem.Pēc eitanāzijas ar CO2 ieelpošanu muguras ādas gabals tika noņemts un līdz apstrādei tika turēts RPMI (Roswell Park Memorial Institute) šķīdumā uz ledus. Asinis tika savāktas ar sirds punkciju šļircēs, kas pārklātas ar etilēndiamīntetraetiķskābi. Pēc tam tika veikta sirds perfūzija, izmantojot fosfātu buferšķīdumu (PBS) (∼ 60 ml) caur kreiso kambara pēc labā ātrija izgriešanas. Veiksmīga perfūzija tika noteikta, novērojot pilnīgunieresun plaušu bālums. Plaušas, nieres, liesa un abi augšstilba kauli tika rūpīgi izņemti un ievietoti RPMI šķīdumā uz ledus līdz parauga apstrādei. Šūnas tika izolētas no līdzvērtīgām ādas audu zonām (∼30 mm2), audus sasmalcinot un sagremojot ar 0.28 vienības/mL Liberase TM (Roche) un 0,1 mg/ml dezoksiribonukleāzes I ( Worthington) PBS ar Ca plus 2 un Mg plus 2 60 minūtes 37 grādos ar kratīšanu. Šūnas tika izolētas no vienasnieresuz vienu dzīvnieku;nieresaudi tika sasmalcināti un sagremoti 2 mg/ml I tipa kolagenāzē (Worthington) 30 minūtes 37 grādu temperatūrā saskaņā ar publicēto protokolu. Plaušu šūnas tika savāktas, sagremot audus PBS (Ca plus 2 un Mg plus 2) ar 1 mg/ml 1. tipa kolagenāzes un 60 U dezoksiribonukleāzes I. Veselas liesas tika sasmalcinātas uz 40 μm šūnu sietiņa un mazgātas ar RPMI šķīdumu. Veselas asinis un šūnas no liesas, kaulu smadzenēm, nierēm un plaušām tika apstrādātas ar 1X sarkano asins šūnu (RBC) līzes buferi (BD Biosciences). Pēc izolācijas/sagremošanas šūnas no visiem audiem tika filtrētas (40 μm), mazgātas ar PBS un pirms skaitīšanas atkārtoti suspendētas RPMI šķīdumā.

Plūsmas citometrijas krāsošana un analīze.Šūnas tika apstrādātas ar Fc Block TruStain FcX (Biolegend) un iekrāsotas ar krāsu Zombie Aqua Viability (Biolegend) saskaņā ar pārdevēja ieteikumiem. Šūnas tika mazgātas un virsmas krāsošana tika veikta, izmantojot pelēm specifiskas fluorescējošas antivielas, kas iegādātas no Biolegend. Dzīvu imūno šūnu (Zombie Aqua-CD45 plus) vārtos tika analizētas dažādas mieloīdo šūnu populācijas. Tika kvantificēts neitrofilu (Ly6CintLy6Ghi) un monocītu (Ly6C plus Ly6G−) procentuālais daudzums un skaits. Reprezentatīvā plūsmas citometrijas noteikšana ir parādīta SI pielikumā, S10. attēlā. Virsmas marķieru ekspresijas procentuālā daļa un vidējā fluorescences intensitāte PA modelī (CXCR4, ICAM1 un CXCR1) tika noteikta, izmantojot fluorescences mīnus vienu (FMO) krāsošanas kontroles neitrofilu vārtos (Ly6Ghi). Visi paraugi tika apstrādāti, izmantojot CytoFLEX plūsmas citometru (Beckman Coulter), un dati tika analizēti ar FlowJo programmatūras versiju 10 (Tree Star).

Fotoaktivācijas (PA) pētījumi.UBC-PA-GFP peles tika noskūtas, un daļa no muguras tika apstarota ar vienu UVB gaismas devu (500 mJ/cm2), kā norādīts iepriekš. UVB gaismai tika pakļauta tikai tā ādas zona, kas tiks pārveidota par fotokonvertēšanu, bet pārējā āda tika pārklāta ar alumīnija foliju. Pēc 24 stundām pēc UVB izraisīta sterila ievainojuma visa UVB apstarotā ādas zona tika pakļauta violetai gaismai (405 nm), izmantojot 50 W gaismas diodes lampu ar 0,37 skaitliskās apertūras (NA) šķiedru (Mightex) ar jaudu. 100 mW (15 min ekspozīcija uz apgabalu). Šī metode tika optimizēta, pamatojoties uz publicētu ādai specifiskas fotokonversijas protokolu (80).Nieresun plaušas tika savāktas un apstrādātas plūsmas citometrijas analīzei 24 stundas pēc PA, kā aprakstīts iepriekš. Pieeja un laika grafiks ir izklāstīti diagrammā 5.A attēlā. GFP plus neitrofilu procentuālais daudzumsnierestika salīdzināts ar to, kas konstatēts pelēm trīs kontroles apstākļos: 1) bez UV un bez PA, 2) UV, bet bez PA un 3) bez UV, bet PA. CXCR4 ekspresijas līmeņi un ICAM1hiCXCR1lo fenotips GFP plus un GFP− neitrofilos ādā unnierestika novērtēti ar plūsmas citometriju, izmantojot pelēm specifiskas fluorescējoši marķētas antivielas, kas iegādātas no Biolegend. Lai noteiktu, vai GFP plus neitrofīlinieresradās no ādas, nevis asinīm, āda vienā peļu grupā tika pakļauta UV gaismai un PA, kā aprakstīts iepriekš (I grupa), savukārt citā grupā āda tika pakļauta UV gaismai, bet PA tika veikta blakus esošajai ādas zonai. nav pakļauts UV gaismai (II grupa) (diagramma SI pielikumā, S7A att.).Nierestika savākti un apstrādāti plūsmas citometrijas analīzei, kā aprakstīts iepriekš.

Gēnu ekspresija un proteomiskās analīzes.Āda,nieres,un plaušu paraugi tika uzglabāti RNAlater šķīdumā (QIAGEN). RNS tika ekstrahēts ar RNeasy komplektu no QIAGEN, un komplementārā DNS (cDNS) tika sintezēta, izmantojot augstas kapacitātes cDNS sintēzes komplektu (Applied Biosystems). Iekaisuma ķīmokīnu, citokīnu un adhēzijas molekulu transkripti tika kvantificēti ar reāllaika qPCR, izmantojot primerus, kas uzskaitīti SI pielikumā, S1 tabulā, un normalizēti līdz 18S transkripta vidējiem līmeņiem. Izmantotā UVB gaismas deva neietekmēja 18S ekspresiju nevienā no orgāniem. MRNS mērķu relatīvā ekspresija tika noteikta, izmantojot standarta formulu 2^ (-Ct) × koeficients. IFN rādītāji tika iegūti no 10 reprezentatīvu interferona stimulētu gēnu (ISG; Mx1, Irf7, Isg15, Isg20, Ifi44, ifit1, ifit3, oasl1, usp18 un ifi27l2a) ekspresijas, kā aprakstīts iepriekš (6). Katra ISG relatīvās izteiksmes vidējais un SD tika noteiktsnierespelēm, kas nav pakļautas UV gaismai (meannoUV un SDnoUV). Pēc tam tos izmantoja, lai standartizētu katra ISG ekspresijas līmeņus ārstēto peļu nierēs (IgG izotips plus UVB vai a-GCSF plus UVB). Pēc tam katrai pelei tika summēti standartizētie ekspresijas līmeņi, lai iegūtu IFN ekspresijas rādītāju; i=katra ISG izteiksme; Gēnu ārstēšana=relatīvais gēnu ekspresijas līmenis pēc apstrādes; un Gene inoUV=relatīvais gēnu ekspresijas līmenis pelēm, kas nav pakļautas UVB gaismai. ∑ 10 i=1=Geneitreatment-meanGeneinoUV SD(GeneinoUV ) . Proteīna līmenis plazmas un ādas audu proteīnu ekstraktos tika mērīts, izmantojot noteiktus analītu paneļus LEGENDplex Mouse Inflammation Panel un Inflammatory Chemokine Panel (Biolegend).

JA iekrāsojas saldēti nieres audi.Ar fizioloģisko šķīdumu perfūzētsnierestika fiksēti 4% paraformaldehīdā 1 stundu istabas temperatūrā un pēc iegremdēšanas 30% saharozes, sasaldēti optimālā griešanas vidē (Sakura Finetek). Pirms IF krāsošanas 5- μm audu sekcijas tika rehidrētas PBS. Audi tika caurlaidīgi ar 0,1% Triton X-100 PBS un pēc tam bloķēti PBS plus 0,1% Triton X-100/5% BSA (liellopu seruma albumīna)/5% truša seruma. . NE un endotēlija šūnas tika noteiktas, krāsojot attiecīgi ar anti-peles NE Cy5 (1:100, Bioss) un anti-peles PECAM-1/CD31 Al488 (1:100, Biolegend) 4 grādu temperatūrā nakti. Neitrofilu klātbūtne organismānierestika apstiprināts, krāsojot ar pretpeles Ly6G Al647 (1:100, Biolegend). Audi tika piestiprināti, izmantojot ProLong Gold ar 4′, 6-diamidino-2-fenilindola (DAPI) montāžas vidi (Invitrogen), un attēloti ar Nikon Eclipse 90i fluorescējošo mikroskopu (Histoloģijas un attēlveidošanas kodols, Vašingtonas Universitāte).

Ādas histoloģiskais novērtējums.Ar formalīnu fiksētas, parafīnā iestrādātas ādas audu sekcijas (4 līdz 5 μm) tika iekrāsotas ar hematoksilīnu un eozīnu Vašingtonas Universitātes Histoloģijas un attēlveidošanas kodolā pirms UV, 1., 2. un 6. dienā pēc UVB apstarošanas (n {{ 7}} sievietes). Āda tika vērtēta aklā veidā pēc šādiem parametriem: dermas/subkutis iekaisums, epidermas šūnu nāve, akantoze, hiperkeratoze, serocelulārās garozas veidošanās un erozija/čūlas. Šie parametri tika novērtēti skalā no 0 līdz 4 atkarībā no smaguma pakāpes un apjoma, izņemot eroziju/čūlu, kas tika novērtēta kā esošs (1) vai nav (0). Reprezentatīvie attēli tika uzņemti, izmantojot NIS-Elements BR 3.{14}}bitu, un apstrādāti programmā Adobe Photoshop ar apgaismojuma pielāgojumiem, kas tika piemēroti visam attēlam. Ir norādīts sākotnējais palielinājums.

Urīna mērījumi.Urīna olbaltumvielu līmenis tika novērtēts ar Bredfordas proteīna testu (Thermo Fisher Scientific). Urīna paraugi tika pārbaudīti 1:40 atšķaidījumā PBS, un olbaltumvielu koncentrācija urīnā tika noteikta, pamatojoties uz zināmu BSA koncentrāciju sērijveida atšķaidījumiem. Urīna albumīna/kreatinīna attiecība tika novērtēta, izmantojot Albuwell albumīna testu un Creatinine Companion Kit (Exocell) saskaņā ar ražotāja norādījumiem.

Cilvēka paraugu ņemšana un plūsmas citometrijas analīze.Šo pētījumu apstiprināja Vašingtonas Universitātes Institūciju pārskata padome (STUDY00001145). Pēc informētas piekrišanas veselas asinis tika savāktas heparinizētās mēģenēs no veseliem brīvprātīgajiem un SLE pacientiem. Neitrofīli (PMN) un PBMC tika izolēti, izmantojot Ficoll-Paque pārtrauktu gradienta atdalīšanu (GE Healthcare). PMN tika attīrīti no eritrocītu granulām ar 5% dekstrāna sedimentāciju. Pēc RBC līzes šūnas tika iekrāsotas ar fluorescējoši marķētām antivielām, kas iegādātas no Biolegend, un CXCR4 ekspresija un ICAM1hiCXCR1lo šūnu procentuālais daudzums tika novērtēts PMN (CD66b plus ) un LDG (CD15 plus , CD14lo un CD10 plus PBMC (19)). Vārtu stratēģija LDG un ICAM1hiCXCR1lo krāsošanai, pamatojoties uz FMO, ir parādīta SI pielikumā, S11. attēlā. Paraugi tika apstrādāti, izmantojot CytoFLEX plūsmas citometru (Beckman Coulter), un dati tika analizēti ar FlowJo programmatūras versiju 10 (Tree Star).

Statistiskās analīzes.Dati tika analizēti, izmantojot GraphPad Prism 7 programmatūru (GraphPad Software Inc.), un uzrādīti kā vidējais ± SEM. Statistiskā atšķirība starp abām datu grupām tika noteikta attiecībā pret neapstarotajām kontrolēm (D-1), izmantojot Studenta testu. Lai noteiktu statistisko nozīmīgumu starp trim grupām, tika izmantota vienvirziena ANOVA ar vairākiem salīdzinājumiem un Tukey post hoc.