Akūta no devas atkarīga poli(pro-17 estradiola) neiroprotektīvā iedarbība mugurkaula kontūzijas traumas peles modelī

Abstrakts

17 -Estradiols (E2) nodrošina neiroaizsardzību muguras smadzeņu bojājumu preklīniskajos modeļos, ja to lieto sistēmiski. Šī pētījuma mērķis bija ilgstoši uzklāt E2 lokāli ievainotajām muguras smadzenēm, izmantojot poli (pro-E2) plēves biomateriālus.

Tā kā cilvēki uzzina vairāk par muguras smadzeņu bojājumiem, mēs sākam saprast, kāda ir tā ietekme uz cilvēku fizisko un garīgo veselību. Lai gan muguras smadzeņu bojājumi var izraisīt daudzas nelabvēlīgas sekas, par laimi, to ietekmi uz atmiņu var kontrolēt.

Pirmkārt, mums ir jāprecizē, kas ir muguras smadzeņu bojājums. Muguras smadzenes ir mugurkaulā aizsargāts nervs, kas ir atbildīgs par norādījumu pārsūtīšanu no smadzenēm uz dažādām ķermeņa daļām. Ja muguras smadzenes ir ievainotas, dažas ķermeņa daļas zaudēs labu savienojumu ar smadzenēm, kā rezultātā tiks ietekmēta ekstremitāšu kustība, sajūta un autonomā kontrole.

Muguras smadzeņu bojājumi var zināmā mērā ietekmēt cilvēku atmiņu, īpaši agrīnā pacientu ar muguras smadzeņu traumām rehabilitācijas stadijā. Muguras smadzeņu traumas var izraisīt personas uzmanības, darba atmiņas un emocionālās apstrādes spējas pasliktināšanos, kas ietekmēs cilvēka atmiņas spēju.

Tomēr šīs negatīvās sekas pakāpeniski samazināsies, pacientiem veicot rehabilitācijas ārstēšanu. Pacienti var uzlabot atmiņu, piedaloties atmiņas spēlēs un citos izziņas treniņos. Tajā pašā laikā fiziskā rehabilitācija veicina arī ķermeņa motorisko un sensoro funkciju atjaunošanu, tādējādi uzlabojot emocionālās un kognitīvās funkcijas.

Mums jāmudina pacienti ar muguras smadzeņu traumām aktīvi piedalīties rehabilitācijas ārstēšanā un neatlaidīgi piedalīties rehabilitācijas apmācībās, lai uzlabotu fizisko un garīgo veselību. Lūdzam ticēt, ka ar pareizas izziņas un pēcoperācijas ārstēšanas palīdzību pacienti var pārvarēt muguras smadzeņu bojājumu ietekmi uz atmiņu un turpināt dzīvot aktīvu dzīvi. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa, un Cistanche var ievērojami uzlabot atmiņu, jo Cistanche var arī regulēt neirotransmiteru līdzsvaru, piemēram, palielināt acetilholīna un augšanas faktoru līmeni, kas ir ļoti svarīgi atmiņai un mācībām. Turklāt Cistanche var arī uzlabot asins plūsmu un veicināt skābekļa piegādi, kas var nodrošināt, ka smadzenes saņem pietiekamu uzturu un enerģiju, tādējādi uzlabojot smadzeņu vitalitāti un izturību.

Noklikšķiniet uz zināt bagātinātājiem, lai uzlabotu atmiņu

Pēc kontūzīvas muguras smadzeņu traumas pieaugušiem peļu tēviņiem poli(pro-E2) plēves tika implantētas subdurāli, un neiroaizsardzība tika novērtēta, izmantojot imūnhistoķīmiju 7 dienas pēc traumas un implantācijas. Šajos pētījumos poli(pro-E2) plēves nedaudz uzlaboja neiroaizsardzību, neietekmējot iekaisuma reakciju. salīdzinot ar ievainotajām kontrolēm.

Lai palielinātu atbrīvoto E2 devu, tika izgatavotas bolus atbrīvojošās poli (pro-E2) plēves, iekļaujot nesaistīto E2 poli (proE2) plēvēs.

Tomēr, salīdzinot ar ievainotajām kontrolēm, bolus izdalošās poli(pro-E2) plēves būtiski neuzlaboja neiroaizsardzību vai neierobežoja iekaisumu ne 7, ne 21 dienu pēc traumas. Turpmākajā darbā galvenā uzmanība tiks pievērsta poli(pro-E2) biomateriālu izstrādei, kas spēj precīzāk atbrīvojot E2 terapeitiskās devas.

IEVADS

Traumatisks muguras smadzeņu bojājums (SCI) ir novājinošs stāvoklis, kas Amerikas Savienotajās Valstīs katru gadu skar vairāk nekā 18,{1}} cilvēkus1, bet tiek lēsts, ka SCI izplatība pasaulē ir no 236 līdz 1009 uz miljonu.2

Pacientiem, kurus skārusi SCI, rodas smagi neiroloģiski traucējumi, tostarp jutības zudums, traucēta zarnu/pūšļa funkcija un paralīzi.3,4 Primārā ietekme uz muguras smadzenēm izraisa neironu nāvi traumas vietā, ko vēl vairāk pastiprina vairākas sekundāras traumu kaskādes, kurās iesaistīti astrocīti un makrofāgi. .

Laika gaitā šie astrocīti veido glia rētu, kas novērš aksonu izplešanos ārpus bojājuma malas.5 Līdz šim nav FDA apstiprinātu neiroprotektīvu zāļu SCI ārstēšanai.

Pētījumi, kas aptver vairākas desmitgades, ir vērsti uz sistēmisku biomolekulu ievadīšanu, lai novērstu neironu zudumu sekundāra trauma dēļ un/vai veicinātu aksonu reģenerāciju, kas galu galā noved pie zaudētās funkcijas atjaunošanas.6 Viena biomolekula, kas SCI preklīniskajos modeļos ir izrādījusi nozīmīgu solījumu, ir sievietes dzimumhormons, 17 -estradiols(E2).

E2 ievadīšana ir plaši labvēlīga centrālajai nervu sistēmai, mazinot iekaisumu,7–9 mazinot glia šūnu reaktivitāti,10 ierobežojot oksidatīvo stresu,11–14 un mazinot glutamāta izraisītu eksitotoksisku neironu nāvi.15 E2 uzlabo funkcionālo atjaunošanos dažādos SCI grauzēju modeļos.10, 16,17 Interesanti, ka vairāku devu sistēmiska E2 ievadīšana izraisa funkcionālo atveseļošanos ātrāk18,19, salīdzinot ar dzīvniekiem, kuri saņem tikai vienu devu.17

Tā kā E2 efektīvāk veicina funkcionālo atjaunošanos, izmantojot vairāku devu shēmas, mūsu mērķis bija stabili atbrīvot E2 lokāli traumas vietā (lai novērstu jebkādu nevēlamu ietekmi), lai apietu problēmas, kas rodas no vairākām E2 devām/sistēmiskām injekcijām.

Šim nolūkam mēs izmantojām poli (priekšzāļu) biomateriālu stratēģiju, kurā dabiskās zāles (E2) vispirms tika funkcionalizētas ar reaktīvām alilgrupām un pēc tam polimerizētas, pievienojot fotoiniciētu tiola-ēna radikāļu ar elastīgu oligo-(etilēnglikola) ditiolu, kā aprakstīts iepriekš. .20 Mēs ieguvām augstas molekulmasas polimēru ķēdes, kas sastāv no E2 prozāles kā atkārtotas vienības polimērā.

Hidrolītiski sadaloties, polimērs pakāpeniski izdala E2 apkārtējā vidē. Vienīgie citi blakusprodukti no tā izdalīšanās ir oglekļa dioksīds un oligo(etilēnglikols) (oEG) (1. attēls). Poli(pro-E2) ķēdes, kas izgatavotas plēvēs vai mikrošķiedrās, var atbrīvot E2 nanomolārā koncentrācijā in vitro laika skalā no mēnešiem līdz gadiem. .20

No šīm poli(pro-E2) sastatnēm izdalītais E2 ir bioaktīvs, un šīs sastatnes veicina neirotrofismu un neiroaizsardzību in vitro, aizsargājot neironus no ūdeņraža peroksīda izraisīta oksidatīvā stresa. Šeit mēs izmantojām poli (pro-E2) plēves kontūzijas SCI peļu modelī tūlīt pēc traumas un novērtējām to neiroprotektīvo spēju in vivo.

Mūsu sākotnējais poli(pro-E2) plēves dizains palielināja neiroaizsardzību akūti (7 dienas pēc traumas) traumas vietā, neietekmējot iekaisuma reakciju. Tā kā poli (pro-E2) plēves izdala nanogramus E2 dienā, mēs izstrādājām citu atbrīvošanas stratēģiju, kurā nesaistītais E2 tika iekļauts poli (pro-E2) matricā. Mēs izvirzījām hipotēzi, ka nesaistītā E2 bolus izdalīšanās var sniegt papildu neiroprotektīvus ieguvumus.

Poli(pro-E2) plēves izdala E2 eksplozijas veidā, kam seko ilgstoša E2 izdalīšanās no polimēra zemākās koncentrācijās. Imunohistoloģiskajā krāsošanā tika novērtēti neironi, astrocīti un makrofāgi/mikroglijas, kas atrodas traumas vietā akūti (7 dienas pēc traumas) un hroniski (21 diena pēc traumas) pēc SCI šo bolus izdalošo poli (pro-E2) plēvju klātbūtnē.

REZULTĀTI UN DISKUSIJA

Poli(pro-E2) plēves atbrīvo E2 nanomolārā koncentrācijā, veicina neironu izaugšanu no muguras saknes ganglija un aizsargā neironus no ūdeņraža peroksīda izraisīta oksidatīvā stresa in vitro.20 Šeit izklāstītā pētījuma mērķis ir noteikt poli(pro-E2) spēju. plēves, lai nodrošinātu neiroaizsardzību in vivo, izmantojot kontūzijas SCI peles modeli.

Pieaugušiem peļu tēviņiem tika izraisīts mērens kontūzijas SCI, un tūlīt pēc traumas poli (pro-E2) plēves tika novietotas tieši virs traumas (2.A attēls). Lai nodrošinātu, ka poli (pro-E2) plēves paliek vietā pēc implantācijas, poli (pro-E2) plēves, kas bija iepildītas ar rodamīnu B, tika implantētas ievainoto dzīvnieku muguras smadzenēs. Septiņas dienas pēc implantācijas muguras smadzenes tika savāktas un attēlotas, izmantojot gaismas mikroskopu (attēls 2B). Visiem dzīvniekiem implantētās rodamīna B ielādētās poli (pro-E2) plēves palika vietā, apstiprinot implantācijas protokolu.

Lai pārbaudītu poli (pro-E2) plēvju spēju nodrošināt neiroaizsardzību un mazināt iekaisumu, pēc mugurkaula kontūzijas traumas tika implantētas poli (pro-E2) plēves (bez rodamīna B), un muguras smadzenes tika savāktas 7 dienas pēc traumas un implantācijas. Tika izgrieztas gareniskās sekcijas (10 μm biezas), centrētas ap traumas epicentru un ar imunitāti marķētas, lai vizualizētu neironus un makrofāgus muguras smadzenēs (3. attēls).

Sekcijas tika marķētas ar NeuN, lai novērtētu neironu klātbūtni, un iekrāsojuma kvantitatīvā analīze atklāja, ka poli(pro-E2) plēves ievērojami palielināja NeuN pozitīvo laukumu ap traumas epicentru, salīdzinot ar ievainotajām kontrolēm, kas nesaņēma plēves implantus (3.A attēls; p.=0.0002). Papildu aksonu krāsošana, izmantojot NFH (neirofilamenta smago ķēdi), atklāja arī implantēto poli(pro-E2) plēvju akūto neiroprotektīvo efektu (3.B attēls; p=0.0017).

Mēs novērojām, ka šīs neiroaizsardzības izmaiņas nebija saistītas ar apoptozes (3. kaspāzes) izmaiņām traumas vietā (atbalsta S1 attēlu; p=0.9966). Arī aktivēto makrofāgu (CD68) krāsošana neatklāja nekādas izmaiņas. būtiskas atšķirības starp dzīvniekiem, kas apstrādāti ar poli(pro-E2) plēvi, un neārstētajiem dzīvniekiem (3.C attēls; p= 0.7207).

Kopumā poli(pro-E2) plēves nedaudz palielina neiroaizsardzību akūti, nemainot iekaisuma reakciju. Poli(pro-E2) plēves akūti palielināja neironu blīvumu par gandrīz 20%, bet plēvēm nebija acīmredzamas pretiekaisuma iedarbības (pamatojoties uz laukums, ko aizņem aktivētie makrofāgi) (3. attēls).

Šis iekaisuma samazināšanās trūkums var liecināt, ka E2 pretiekaisuma un neiroprotektīvās devas ir atšķirīgas un ka abas nav sasniegtas ar pašreizējo plēves sastāvu.20 Mēs izvirzījām hipotēzi, ka palielināta E2 izdalīšanās no poli(pro-E2) plēvēm var akūti samazināt iekaisumu. un nodrošina spēcīgāku neiroprotektīvu reakciju.

Lai palielinātu akūti atbrīvotā E2 devu, poli(pro-E2) plēves tika modificētas tā, lai bolus E2 izdalīšanās notiktu tūlīt pēc implantācijas. Pēc E2 bolus izdalīšanas sekos polimēra sadalīšanās, lai atbrīvotos E2 tādā pašā koncentrācijā kā iepriekš. Iepriekš aprakstītais eksperiments tika atkārtots, izmantojot šīs bolus atbrīvojošās poli (pro-E2) plēves, un neiroaizsardzība un iekaisums tika novērtētas 7 dienas pēc traumas (dpi).

Tomēr papildu ieguvuma vietā bolusizdalošās poli(pro-E2) plēves būtiski nepalielināja NeuN pozitīvo zonu, salīdzinot ar ievainotajām, neapstrādātajām kontrolēm (4.A attēls; p=0.6770). Bolusu atbrīvojošās poli(proE2) plēves palielināja CD68 ekspresiju, taču pieaugums statistiski neatšķīrās (p= 0.1780).

GFAP (astrocītu) un Iba1 (mikrogliju) ekspresijas palielināšanās dēļ tika novērotas arī glia reaktivitātes un mikroglia iekaisuma pieaugošās tendences bolus atbrīvojošo poli(pro-E2) plēvju klātbūtnē; tomēr šis pieaugums nebija statistiski lielāks par to, kas tika novērots ievainotajām, neapstrādātajām kontrolēm (attiecīgi p=0.3233 un p=0.3053). Kopumā bolus izdalošās poli (pro-E2) plēves nepastiprināja neiroaizsardzību, un astrocītu reaktivitāte un makrofāgu/mikrogliju klātbūtne netika samazināta, kā sākotnēji tika uzskatīts.

Tā kā atšķirības starp ievainotiem, neārstētiem dzīvniekiem un ievainotiem, ar bolus izdalošiem poli(proE2) plēvi apstrādātiem dzīvniekiem netika novērotas akūtā 7 dpi laika punktā, turpmākai izmeklēšanai tika izvēlēts hronisks laika punkts, jo poli(pro-E2) plēves. var atbrīvotE2 ilgstoši.20 Iepriekš aprakstītais eksperiments tika atkārtots ar bolusizdalošās poli(pro-E2) plēvēm, bet dzīvnieki tika hroniski novērtēti ar 21 dpi (5. attēls).

Muguras smadzenes tika marķētas tiem pašiem šūnu tipiem, kas minēti iepriekš. Pēc analīzes tika novērota tendence palielināties NeuN laukuma daļai dzīvniekiem, kuriem tika implantēta poli(pro-E2) plēve, salīdzinot ar ievainotajiem, neārstētajiem dzīvniekiem (5.A attēls; p=0.0897). Turklāt tika novērotas tendences, kad bolus izdalošās poli(pro-E2) plēves samazināja CD68 un GFAP ekspresijas daļu, salīdzinot ar datiem no neapstrādātiem, ievainotiem dzīvniekiem (5.B attēls, C; p=0.0859 un p=0.2780).

Tomēr neviena no tendencēm nebija statistiski atšķirīga. No otras puses, Iba1 marķētām audu sekcijām no bolusa atbrīvojošiem poli(pro-E2) ārstētiem dzīvniekiem bija augstāka ekspresija, salīdzinot ar datiem no neapstrādātām, ievainotām kontrolēm (p < 0,0001). Mūsu iepriekšējais darbs liecina, ka poli(pro) -E2) plēves, kas uzlietas uz 15 mm × 15 mm segstikliņiem, atbrīvo aptuveni 266 ng E2 dienā20, kas nozīmē aptuveni 2 ng E2 dienā no šeit izmantotajām plēvēm (1 mm × 1,8 mm). Bolusu atbrīvojošās poli(pro-E2) plēves akūti pēc implantācijas atbrīvo papildu 40 ug nesaistītā E2.

Pētījumi, kas koncentrējas uz E2 izmantošanu grauzēju SCI modeļos, liecina, ka zemas estrogēna devas (10 ug/kg), ko ievada intravenozi, mazina reaktīvo gliozi un nodrošina neiroprotekciju, vienlaikus mazinot iekaisuma notikumus, kavējot apoptozi un palielinot angiogēzi.21 Un otrādi, lielas, sistēmiskas estrogēna devas rada. negatīvas sekas, kas ietver dziļo vēnu trombozes un vēža palielināšanos22,23 un sievišķo fizisko īpašību attīstību vīriešiem. Tas ir ievērības cienīgs, jo lielākā daļa E2 pētījumu ir vērsti uz E2 sistēmisku ievadīšanu intravenozi vai intraperitoneāli.

Ņemot vērā drošības bažas, lietojot lielas E2 devas sistēmiski, ir svarīgi optimizēt E2 koncentrāciju vietējai ievadīšanai ievainotajās muguras smadzenēs, lai novērstu blakusparādības. Līdz šim tikai viens pētījums ir piegādājis E2 no biomateriāla, izmantojot nanodaļiņas, lai fokusētu E2 (2,5 ug vai 25 ug). Izdalīšanās no nanodaļiņām strauji samazināja iekaisumu akūti kontūzijas SCI žurkas modelī.9 Statistiski nozīmīgas atbildes trūkums mūsu datos (4. un 5. attēls), iespējams, ir saistīts ar nelīdzsvarotību E2 daudzumā, ko mēs lokāli piegādājam muguras smadzenēm ar pārāk daudz E2 (40 ug) izdalās akūti, bet ļoti maz (2 ng) izdalās hroniski.

Lai gan tas, ko mēs novērojam no šiem datiem, ir pieticīgas tendences, šis pētījums izceļ E2 dozēšanas nozīmi, lai veicinātu neiroprotezēšanu in vivo. Sākotnējās E2 devas samazināšana un poli(pro-E2) biomateriāla noārdīšanās kinētikas pielāgošana varētu palīdzēt mazināt šo problēmu un, iespējams, nodrošināt labākus neiroprotektīvus rezultātus.

Lai gan šis pētījums tika veikts tikai vīriešiem, ir ļoti svarīgi novērtēt šo poli (pro-E2) plēvju ietekmi uz abiem dzimumiem, lai noteiktu šī biomateriāla derīgu translācijas potenciālu. Pētījumi ir parādījuši, ka pēc SCI paaugstināts estrogēna līmenis sievietēm var būt daļēji atbildīgs par to labākajiem funkcionālajiem rezultātiem salīdzinājumā ar vīriešiem.24 Tā kā sievietēm ir palielināts estrogēna daudzums, jebkurai biomateriāla stratēģijai, kurā izmanto estrogēnus, ir jāņem vērā šis paaugstinātais līmenis un jāmaina materiāls. Attiecīgi atbrīvojiet kinētiku, lai nodrošinātu, ka ievadītā deva vīriešiem un mātītēm paliek vienāda.

METODES

Poli(pro-E2) plēvju izgatavošana.

Poli(pro-E2) polimērs P1 tika sintezēts un raksturots, kā detalizēti aprakstīts iepriekš.20 Saskaņā ar gēla caurlaidības hromatogrāfiju (GPC) polimēra masas vidējā molekulmasa ir MW ~ 80 kDa un dispersitāte Đ ~ 3. Poli(pro-E2) plēves tika izgatavotas, izšķīdinot polimēru hloroformā (5 masas %/masas; polimērs/hloroforms), uzlejot šķīdumu uz 15 mm × 15 mm stikla segstikliņiem (100 μL šķīdums katrā segstikliņā) un atstājot tos. nožūt pa nakti vakuumā (<100 mTorr) at room temperature (RT). In a subset of experiments, the polymer solution was supplemented with rhodamine B (0.005 wt %/wt; rhodamine B/chloroform) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) to verify the presence of the poly(pro-E2) films in animals post-implantation.
Lai izveidotu poli(pro-E2) plēves ar nesaistītu E2, plēves tika izgatavotas, pievienojot polimēra šķīdumam nesaistītu E2 (Abcam, Kembridža, MA) (0,0625 mas. %/wt; E2/hloroforms) pirms pilienu liešanas. šķīdumu uz pārklājuma. Pirms implantācijas segstikliņi ar plēvi tika sterilizēti, izmantojot ultravioleto (UV) starojumu 30 minūtes, un plēves tika nolobītas no segstikliņiem sterilā bioloģiskās drošības skapī. Pēc tam poli (pro-E2) plēves tika sagrieztas 1 mm × 1, 8 mm gabalos, kas bija piemēroti implantēšanai pieaugušai pelei, kā aprakstīts tālāk.

Kontūzijas muguras smadzeņu traumas un poli(pro-E2) plēvju implantācija.

Visas ķirurģiskās un pēcoperācijas aprūpes procedūras apstiprināja Rensselaer PolytechnicInstitute un Ohaio štata universitātes institucionālās dzīvnieku aprūpes un lietošanas komitejas (IACUC). Lai izraisītu kontūziju SCI, pieaugušie C57BL/6 peļu tēviņi (no 10- līdz 12- nedēļu veci), kas iegādāti Džeksonas laboratorijā (krājuma Nr. 000664; Bar Harbor, ME), tika anestēzēti ar intraperitoneālu injekciju. ketamīna (80 mg/kg) un ksilazīna (10 mg/kg). Dzīvnieku aizmugurējās daļas tika noskūtas un aseptiski sagatavotas, izmantojot 70% etanolu un betadīnu.

Pēc tam, kad dzīvnieks tika novietots uz sildīšanas paliktņa, kas tika uzturēts 37 grādu temperatūrā, tika atvērti ādas un muskuļu slāņi, lai atklātu mugurkaulu, un krūšu kurvja devītajam (T9) skriemelim tika veikta muguras laminektomija, lai atklātu muguras smadzenes. Šajā līmenī tika izraisīts mērens (75 kdyn) sasitums SCI, izmantojot Infinite Horizons triecienelementu (Precision Systems andInstrumentation, Lexington, KY).

Kad hemostāze tika sasniegta, cietais apvalks tika atvērts (2. attēls) un zem cietā kaula un virs muguras smadzenēm tika novietota poli(pro-E2) plēve vai bolus atbrīvojošā poli(pro-E2) plēve (1 mm × 1,8 mm). traumas vieta. Kontroles dzīvniekiem dura tika atvērta, bet poli(pro-E2) plēves netika implantētas. Pēc tam muskuļu slāņi tika aizvērti, izmantojot sterilas šuves, un āda tika aizvērta, izmantojot sterilus metāla brūču klipus.

Peles saņēma 2 ml sterila fizioloģiskā šķīduma, ko injicēja subkutāni, un tika atgrieztas būros un uz nakti novietotas uz priekšmetstikliņu sildītāja, kas iestatīts uz 37 grādiem. Lai nodrošinātu pareizu hidratāciju un novērstu infekcijas, pelēm katru dienu pirmajās 5 dienās pēc traumas (dpi) subkutāni injicēja 1–2 ml sterila fizioloģiskā šķīduma un Gentocin (1 mg/kg). Eksperimentu laikā urīnpūšļi tika manuāli izspiesti divas reizes dienā. Visi dzīvnieki tika izmitināti parastos apstākļos 12-stundu gaismas-tumsas ciklā ar ad libitum piekļuvi barībai un ūdenim.

Audu novākšana.

Noteiktajos beigu laika punktos 7 vai 21 dpi pelēm injicēja letālu ketamīna/ksilazīna devu (1,5 reizes ķirurģiskā deva) un transkardiāli perfūzēja ar 0,1 mfosfātu buferšķīdumu (PBS; pH 7,4). kam sekoja 4% paraformaldehīds (PFA; pH 7,4). Muguras smadzenes tika noņemtas, 2 stundas pēc fiksācijas 4% PFA un pēc tam nakti tika pārnestas uz 0,2M fosfāta buferšķīdumu (PB; pH 7,4).

Muguras smadzenes tika aizsargātas ar krioaizsardzību ar 30% saharozi 48 stundas 4 grādu temperatūrā un pēc tam bloķētas 10 mm segmentos, kas centrēti ap traumas vietu ar muguras kolonnām uz augšu. Šīs sekcijas tika iegultas Tissue-Tek optimālās griešanas temperatūras vidē (VWR International, Radnor, PA) un ātri sasaldētas uz sausa ledus. Visas muguras smadzenes tika sadalītas 10 μm garumā uz Microm HM505E kriostata, kas novietotas uz ColorFrost Plus priekšmetstikliņiem (The ScientermoFisher). Waltham, MA), un pēc tam uzglabāja -20 grādu temperatūrā, līdz to izmanto imūnkrāsošanai.

Imūnhistoķīmija un kvantitatīva noteikšana.

Priekšmetstikliņus 1 stundu atkausēja priekšmetstikliņu sildītājā un pēc tam 3 reizes skaloja 0,1 MPBS. Endogēnā peroksidāzes aktivitāte tika apturēta, 15 minūtes RT inkubējot priekšmetstikliņus 6% H2O2, kas atšķaidīts ar metanolu. Pēc 3 reizes mazgāšanas 0,1 M PBS, sekcijas tika inkubētas ar 4% BSA un 0,1% Triton X-100 0,1 M PBS uz 1 h, kam seko primāro antivielu inkubācija uz nakti 4 grādos vai RT (1. tabula).

Priekšmetstikliņus 1 stundu RT inkubēja ar atbilstošām biotinilētām sekundārajām antivielām (1:1000; Vector Laboratories, Burlingame, CA). Lai vizualizētu saistīto antivielu, priekšmetstikliņus 1 stundu inkubēja ar Vectastain Elite-ABC (Vector Laboratories) un 10 minūtes attīstīja ar ImmPACT3, 3′-diaminobenzidīnu (DAB) vai Vector SG substrātu (Vector Laboratories).

Šīs sekcijas tika dehidrētas, secīgi inkubējot 2 × 2 minūtes 70% un 90% etanolā, 2 × 3 minūtes 100% etanolā, kam sekoja 3 × 3 minūtes Histoclear un visbeidzot pārklājot ar Permount (ThermoFisher Scientific). Kvantitatīvās analīzes veikšanai tika izmantotas sešas sekcijas katram dzīvniekam, kas atrodas 100 μm attālumā no ievainotajām muguras smadzenēm.

Imunomarķētās sekcijas tika attēlotas, izmantojot Axioplan 2 attēlveidošanas mikroskopu, kas aprīkots ar AxioCamdigital kameru un AxioVision versiju 4.8.2 programmatūru (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Vācija) un 5x objektīvu.

Pozitīvo pikseļu skaits katrā sadaļā tika skaitīts, izmantojot MIPAR attēlu analīzes programmatūru (MIPAR, Worthington, OH), lai aprēķinātu pozitīvās laukuma daļas procentuālo daļu katrā sadaļā. Katram traipam tika aprēķināts un ziņots par sešu sekciju vidējo pozitīvo laukumu vienam dzīvniekam.

Statistiskā analīze.

Visi dati ir norādīti kā vidējā ± standarta novirze. Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot GraphPad Prism 9 Statistical Software (GraphPad Software, Sandjego, CA). Visos eksperimentos katrā grupā tika izmantoti 5–6 dzīvnieki, kuru izcelsme bija vismaz no divām dažādām dzīvnieku partijām. Lai pārbaudītu atšķirības starp kontroles un poli(pro-E2) plēvju grupām, tika izmantots Studenta t-tests (3., 4. un 5. attēls). Nozīmīgums tika noteikts pie p Mazāks vai vienāds ar 0.05.

Papildu materiāls

Papildu materiālu skatiet PubMed Central tīmekļa versijā.

PATEICĪBA

Autori pateicas Wenmin Lai par palīdzību peles operācijās.

Finansējums

Šis darbs saņēma atbalstu no Kreiga H. Neilsena fonda stipendijas (granta 468116) un Amerikas paralizēto veterānu pētniecības fonda stipendijas (granta 3171) MKG un no NIH R01 (granta NS092754) un Ņujorkas štata muguras smadzeņu traumu pārskatīšanas padomes institucionālā atbalsta stipendijas C3224G5. Visi darbi ar dzīvniekiem tika veikti ar Ohaio štata universitātes Neirozinātnes departamenta Ķirurģiskā kodola palīdzību, ko atbalsta NINDS Grant P30NS104177.

ATSAUCES

(1). Nacionālais muguras smadzeņu traumu statistikas centrs. (2020) Muguras smadzeņu traumu fakti un skaitļi īsumā, Alabamas Universitāte Birmingemā, Birmingema, AL.

(2). Cripps RA, Lee BB, Wing P, Weerts E, MacKay J un Brown D (2011) Globālā karte traumatisku muguras smadzeņu traumu epidemioloģijai: ceļā uz dzīvu datu krātuvi traumu profilaksei. Muguras smadzenes. 49, 493–501. [PubMed: 21102572]

(3). Donovan WH (2007) Muguras smadzeņu traumas — pagātne, tagadne un nākotne. Journal of Spinal CordMedicine 30, 85-100.

(4). Pickelsimer E, Shiroma EJ un Wilson DA (2010) Valsts mēroga izmeklēšana par medicīniski apmeklētiem nelabvēlīgiem veselības stāvokļiem personām ar muguras smadzeņu traumu. J. Spinal Cord Med. 33 (3), 221–231. [PubMed: 20737795]

(5). Sudrabs J. un Millers JH (2004) Reģenerācija aiz glialās rētas. Nat. Rev. Neurosci. 5 (2), 146–156. [Pubmed: 14735117]

(6). Varma AK, Das A, Wallace G, Barry J, Vertegel AA, Ray SK, and Banik NL (2013) SpinalCord Injury: A Review of Current Therapy, Future Treatments and Basic Science Frontiers.Neurochem. Res. 38, 895–905. [PubMed: 23462880]

(7). Zendedel A, Mönnink F, Hassanzadeh G, Zaminy A, Ansar MM, Habib P, Slowik A, Kipp M un Beyer C (2018) Estrogēns vājina lokālu iekaisuma izpausmi un aktivāciju pēc muguras smadzeņu traumas. Mol. Neirobiol. 55 (2), 1364–1375. [PubMed: 28127698]

(8). Lee JY, Choi HY, Ju BG un Yune TY (2018) Estrogēns mazina neiropātiskas sāpes, ko izraisa muguras smadzeņu traumas, kavējot mikrogliju un astrocītu aktivāciju. Biochim. Biofizija. Acta, Mol. Pamats Dis. 1864 (7), 2472–2480. [PubMed: 29653184]

(9). Cox A, Varma A, Barry J, Vertegel A un Banik N (2015) Nanodaļiņu estrogēns žurku muguras smadzeņu traumā izraisa ātru pretiekaisuma iedarbību plazmā, cerebrospinālajā šķidrumā un audos.J. Neirotrauma 32 (18), 1413–1421. [PubMed: 25845398]

(10). Sribnick EA, Samantaray S, Das A, Smith J, Matzelle DD, Ray SK un Banik NL (2010) Hroniska muguras smadzeņu traumas ārstēšana ar estrogēnu uzlabo žurkām. J. Neurosci. Res. 88 (8), 1738–1750. [Pubmed: 20091771]

(11). Honda K, Shimohama S, Sawada H, Kihara T, Nakamizo T, Shibasaki H un Akaike A (2001) Negenomiska antiapopotiskā signāla transdukcija ar estrogēnu kultivētos kortikālajos neironos. J.Neurosci. Res. 64 (5), 466–475. [Pubmed: 11391701]

(12). Sribnick EA, Wingrave JM, Matzelle DD, Ray SK un Banik NL (2003) Estrogēns kā neiroprotektīvs līdzeklis muguras smadzeņu traumu ārstēšanā. Ann. NY Akad. Sci. 993 125–133. [PubMed: 12853305]

For more information:1950477648nn@gmail.com