Dendrimera-tesaglitazara konjugāts izraisa mikroglia fenotipa maiņu un pastiprina amiloido fagocitozi† 2. daļa

In vitro bioloģiskie testi

Šūnu kultūra. BV2 peles mikroglia šūnu līnija tika iegūta no Mičiganas Bērnu slimnīcas šūnu kultūras centra.

Pēdējos gados zinātnieki ir atklājuši, ka šūnu kultūra ir cieši saistīta ar cilvēka atmiņu. Pētījumi ir parādījuši, ka, pētot šūnu kultūru, var atklāt molekulāros mehānismus atmiņā un mācīšanās procesā, tādējādi uzlabojot cilvēka kognitīvās spējas un atmiņu.

Šūnu kultūra attiecas uz bioloģisko šūnu ievietošanas procesu barotnē, kas satur būtiskas barības vielas, lai tās augtu un vairoties in vitro apstākļos. Šūnas ir dzīvības pamatvienības, un šūnu kultūra nodrošina zinātniekiem platformu šūnu uzvedības un dzīvības aktivitāšu izpētei. Pētot šūnas, zinātnieki ir atklājuši daudz informācijas par neironu augšanu un sinaptiskajiem savienojumiem. Šie atklājumi var ne tikai palīdzēt cilvēkiem labāk izprast, kā darbojas smadzenes, bet arī palīdzēt izstrādāt jaunas ārstēšanas metodes un zāles.

Pēdējo gadu pētījumi liecina, ka šūnu kultūra ir cieši saistīta arī ar cilvēka atmiņu. Zinātnieki ir atklājuši, ka cilvēka atmiņas veidošanai un uzturēšanai ir nepieciešama liela molekulārā regulēšana un signālu piegāde. Šiem signālu piegādes un regulēšanas mehānismiem ir daudz līdzību ar mehānismiem šūnu kultūrā. Pētot signālu piegādes un regulēšanas mehānismus šūnu kultūrā, zinātnieki var labāk izprast cilvēka atmiņu un mācīšanās mehānismus.

Turklāt daži pētījumi ir arī parādījuši, ka šūnu kultūra noteiktos veidos var uzlabot cilvēka atmiņu un mācīšanās spējas. Piemēram, izmantojot metodi, ko sauc par "elektrisko stimulāciju", var stimulēt šūnu darbību un savienojumu starp neironiem, tādējādi uzlabojot cilvēka kognitīvās spējas un mācīšanās efektus. Lai gan šī metode joprojām ir laboratorijas pētījumu stadijā, nākotnē tā varētu kļūt par jaunu kognitīvās apmācības metodi.

Rezumējot, pastāv cieša saikne starp šūnu kultūru un cilvēka atmiņu. Izpētot šūnas, mēs varam labāk izprast cilvēka kognitīvo mehānismu un atmiņas mehānismu, kā arī palīdzēt izstrādāt jaunas ārstēšanas metodes un kognitīvās apmācības metodes. Cerēsim uz šūnu kultūras tehnoloģiju ieguldījumu cilvēcei nākotnē! Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa, un Cistanche var ievērojami uzlabot atmiņu, jo Cistanche ir antioksidanta, pretiekaisuma un pretnovecošanās iedarbība, kas var palīdzēt samazināt oksidācijas un iekaisuma reakcijas smadzenēs, tādējādi aizsargājot cilvēka veselību. nervu sistēma. Turklāt Cistanche var arī veicināt nervu šūnu augšanu un atjaunošanos, tādējādi uzlabojot neironu tīklu savienojamību un darbību. Šie efekti var palīdzēt uzlabot atmiņu, mācīšanās spējas un domāšanas ātrumu, kā arī var novērst kognitīvo disfunkciju un neirodeģeneratīvo slimību rašanos.

Noklikšķiniet uz zināt papildinājumus, lai uzlabotu atmiņu

BV2 šūnas tika kultivētas Dulbecco modificētajā EaglesMedium (DMEM) barotnē ar 10% termiski inaktivētu liellopu augļa serumu (HI FBS) un 1% penicilīnu/streptomicīnu (P/S) pie 37 grādiem un 5% CO2.

Kad šūnas kultivēšanas kolbā sasniedza saplūšanu, šūnas tika ievietotas jaunā kolbā, izmantojot 0,05% tripsīna-etilēndiamīna tetraetiķskābi (EDTA). Eksperimentiem BV2 šūnas tika iesētas DMEM ar 5% HIFBS un 1% P/S. 24–48 stundas vēlāk šūnas tika stimulētas ar 100 ng ml-1 (300 EU ml-1) LPS 3 stundas, lai ļautu šūnām iekļūt pro-iekaisuma (M1) fenotipā, lai modelētu neiroinflammatorisko vidi, kas pastāv daudzās neiroloģiskās slimībās.

Pēc tam šūnas kopā apstrādāja ar LPS un vai nu brīvu Tesa, vai D-Tesa dažādās koncentrācijās 48 rokas, pēc tam supernatants un šūnas tika savāktas apstrādei. Šūnas, kas nekad nav apstrādātas ar LPS (bez LPS), un šūnas, kas visu laiku tika apstrādātas tikai ar LPS (tikai LPS), kalpoja kā kontroles grupas. Brīvie Tesa un D-Tesa izejas šķīdumi tika sterilizēti, izmantojot poli(ētera sulfonus) 0,2 µm filtrus.

D-Tesa šķīst šūnu barotnē. Tesa tika izšķīdināts, izmantojot dimetilsulfoksīdu (DMSO) mazākā par 0,1% (v/v) galīgajā koncentrācijā. Citotoksicitāte, slāpekļa oksīda tests un TNF-ELISA. Citotoksicitātes testam šūnas tika apstrādātas, kā aprakstīts iepriekš, 96-iedobes plāksnē, un pēc tam brīvās Tesa un D-Tesa citotoksicitāte tika novērtēta ar MTT testu, ievērojot ražotāja norādījumus.

Slāpekļa oksīda noteikšanai šūnas tika apstrādātas, kā aprakstīts iepriekš, 12-iedobju plāksnēs, un pēc tam tika savākti apstrādāto šūnu supernatanti un nekavējoties tika noteikts slāpekļa oksīda līmenis, ievērojot Griess reaģenta ražotāja protokolu.

Lai veiktu TNF-ELISA, šūnas tika apstrādātas, kā aprakstīts iepriekš, 12-iedobju plāksnēs, un pēc tam supernatanti no apstrādātajām šūnām tika savākti un uzglabāti -80 grādos, līdz tie bija gatavi turpmākai apstrādei.

Pēc tam paraugus atkausēja uz ledus un TNF-ELISA testu veica, ievērojot ražotāja protokolu. Šajos pētījumos gan D-Tesa, gan brīvā Tesa tika apstrādāta ar ultraskaņu un virpuļota, līdz tie abi pilnībā izšķīst. Lai šķīdinātu brīvo Tesa, tas vispirms tika izšķīdināts DMSO pirms atšķaidīšanas, kur DMSO galīgā koncentrācija bija zem 0,1% (v/v) visiem brīvajiem Tesa paraugiem.

Tā kā D-Tesa šķīst šūnu kultūras barotnē, DMSO šiem paraugiem netika pievienots. Allin vitro pētījumos gan brīvās Tesa, gan D-Tesa grupas šūnām tika uzklāts līdzvērtīgs daudzums brīvu vai konjugētu zāļu.

Kvantitatīvā reāllaika PCR (qRT-PCR). Šūnas tika apstrādātas, kā aprakstīts iepriekš, 12-iedobju plāksnēs, un pēc supernatanta savākšanas šūnas tika savāktas Invitrogen™ TRIzol™ reaģentā (no Fisher Scientific), un RNS tika ekstrahēts, ievērojot ražotāja protokolu. Iegūtās RNS koncentrācija un tīrība tika analizēta, izmantojot Nanodrop.

Ekvivalenti RNS daudzumi no katra parauga tika pārveidoti par cDNS, ievērojot ražotāja protokolu High CapacitycDNA reversās transkripcijas komplektam (no Thermo Fisher Scientific Applied Biosystems).

Iegūtā cDNS tika izmantota qRT-PCR analīzei, izmantojot FAST-SYBR zaļo reaģentu un ievērojot ražotāja protokolu. Ct vērtības tika aprēķinātas ar mašīnu, un dati tika analizēti, izmantojot 2-ΔΔCt metodi.

Katram atšķirīgajam marķierim ΔΔCt vērtība tika aprēķināta, atņemot ΔCt grupai Bez LPS no ΔCt katram paraugam. ΔCt vērtība bija interesējošā gēna Ct vērtība mīnus GAPDH Ct katram konkrētajam paraugam.

Kad 2−ΔΔCt tika aprēķināts visām grupām, tās visas tika normalizētas uz grupu Bez LPS, tādējādi piešķirot bez LPS grupas relatīvo ekspresijas līmeni 1.0 visiem marķieriem. ForqRT tika izmantotas uz priekšu un atpakaļ vērstās primeru sekvences. -PCR ir parādīts zemāk esošajā tabulā. Visas secības tiek pārrakstītas no 5′→3′.

Turklāt no BIORAD tika iegādāti komerciāli pieejami primeri, kas paredzēti iNOS/Nos2 (qmmuCID0023087), TLR4 (qmmuCID0023548), CD206/Mrc1 (qmmuCID0012670), TGF- 1 (qmmuCID0017), qmmuCID0017 (qmmuCID0017). 1 (qmmucid0024846), CD36 (qmmucid0014852), Ide(qmmucid0049796), MMP9 (qmmucid0021296), CCL1(qmmuced0038249), TLR8 (qmmuced0039837), CDmucid06m06m00 404) un PPAR (qmmucid0018821). Fagocitozes tests.

-amiloīda brīvās Tesa un D-Tesa onfagocitozes ietekme tika noteikta, izmantojot iepriekš aprakstīto metodi.47 Īsumā, HiLyte™ milti ar 488-marķēto -amiloīdu1–42 (no Anaspec Inc.) tika izšķīdināti DMSO (galīgā DMSO koncentrācija). zem 0,5% (v/v)) un atšķaidīts līdz 5 µg ml-1 PBS.

Pēc šūnu apstrādes ar Tesa un D-Tesa ar iepriekš aprakstīto apstrādes shēmu šūnām 2 stundas tika uzklāts -amiloīda šķīdums. Pēc tam šūnas trīs reizes nomazgāja ar Henka līdzsvaroto sāls šķīdumu ar divvērtīgiem katjoniem (kalciju un magniju), no iedobēm izņēma, izmantojot tripsīnu, un atkārtoti suspendēja FACS buferšķīdumā (no Invitrogen).

Paraugi tika uzglabāti uz ledus un nekavējoties tika palaisti ar Sony Cell Sorter SH800 plūsmas citometrijas mašīnu, un dati tika analizēti ar saistīto programmatūru.

Vārti tika iestatīti, izmantojot šūnas, kas nav apstrādātas ar fluorescējošu amiloīdu, un parādītie rezultāti ir katras grupas šūnu procentuālais daudzums, kas uzrādīja fluorescenci virs fona fluorescences.

Katrai grupai tika ziņots arī par HiLyte™ 488-marķētā amiloīda vidējā fluorescējošā intensitāte (MFA). Šis tests tika veikts divos eksemplāros.Statistika. Visi parādītie dati ir trīs atsevišķu eksperimentu rezultāts, katrs veikts trīs eksemplāros, ja vien nav norādīts citādi. Lai veiktu statistikas datus, tika izmantotas GraphPad Prism 5 un Microsoft Excel.

Tika veikti divpusēji, pārī savienoti Studenta t testi ar BonferroniCorrection. Grūbsa tests tika izmantots, lai noteiktu novirzes. GraphPad Prism 5 operētājsistēmai Windows tika izmantots datu attēlošanai (Sandjego, Kalifornija). Parādītie dati ir vidējais + SEM.

Rezultāti un diskusija

D-Tesa sintēze un raksturojums

Lai nodrošinātu mērķtiecīgu, intracelulāru piegādi uz aktivizētām mikroglia šūnām smadzenēs, Tesa tika kovalenti konjugēta uz G4-PAMAM-OH virsmas ar šķeļamām estera saitēm starp zāļu un dendrimera-savienotāju (1. attēls).

Pirmajā posmā Tesa (1) tika reaģēts ar tetrametilēnglikola azīdu (TEG-azīdu) (2), lai iegūtu Tesa-TEG-azīdu (3), kuram ir estera saite starp zāļu un saiti (1. att.).

Savienojuma (3) HPLC uzrādīja aiztures laiku 13,4 minūtes ar tīrību virs 99% (S1B† att.). (3) masas spektrs uzrādīja maksimumu 610,13 [M + 1]+, kas atbilst Tesa-TEG-azīda molekulmasai, kas vēl vairāk apstiprina produkta veidošanos (S2† att.). Atsevišķi G4-PAMAM-OH dendrimers (4) tika reaģēts ar 5-heksīnskābi, izmantojot esterifikācijas reakciju, lai iegūtu D-YNE (5) (1.B att.).

Visbeidzot, Tesa-TEG-azīds (3) un D-YNE (5) tika reaģēts ar ļoti efektīvu vara-katalizīda-alkīna cikloaddīcijas (CuAAC) klikšķa reakciju, veidojot D-Tesa (6) (1.B att.).48 1H KMR. apstiprināja veiksmīgu visu starpproduktu un galaprodukta sintēzi; D-Tesa (6) saturēja raksturīgos dendrimeru un narkotiku saistītāju protonu pīķus, kas demonstrē veiksmīgu D-Tesa sintēzi (2. att. A).

Galīgā D-Tesa konjugāta KMR atklāja, ka katram dendrimeram tika pievienotas vidēji desmit Tesa molekulas. HPLC apstiprināja veiksmīgu kovalento konjugāciju, jo D-Tesa uzrādīja nobīdi gan no D-YNE, gan TesaTEG-azīda (2.B un S1† att.).

Tesa ir vāja šķīdība ūdenī, tiek lēsta 0,0035 mg ml–1,49 Tesa onhidroksildendrimēra konjugācija uzlaboja tā šķīdību ūdenī par vairākām kārtām, salīdzinot ar šo novērtējumu. D-Tesa bija šķīdība ūdenī pie 22 mg ml-1, un, tā kā Tesa veido ∼ 19% no D-Tesa masas, tika izšķīdināts 4,2 mg ml-1 Tesa ekvivalents (3.A att.).

Dendrimera nodrošinātā palielinātā šķīdība atvieglo formulēšanu un novērš nepieciešamību pēc potenciāli toksiskām palīgvielām.50 Šīs priekšrocības ir papildus dendrimera lieliskajai spējai piegādāt brīvas zāles caur BBB mikroglijām in vivo un, iespējams, samazina deva, kas nepieciešama, lai sasniegtu terapeitisko efektu.18–28 Visbeidzot, D-Tesa vidējais izmērs bija 7,75 ± 0,29 nm (S3† att.) un zeta potenciāls 2.86 ± 0,38 mV (attiecīgi N=5 un N=3 mērījums).

Zāļu izlaišana

Mēs izstrādājām D-Tesa, lai atbrīvotu Tesa intracelulāri aktivēto mikrogliju zemā pH un augstas esterāzes koncentrācijas vides inendosomās/lizosomās. Mēs jau iepriekš ziņojām, ka PAMAM dendrimeri galvenokārt iekļūst šūnās ar šķidruma fāzes endocitozi, un pūslīši, kas satur konjugātus, pārvēršas lizosomās.

Mēs inkubējām D-Tesa 37 grādu temperatūrā nātrija citrāta buferšķīdumā (pH 5,5) esterāžu klātbūtnē, lai atdarinātu lizosomu apstākļus, kā tas tika veikts iepriekš.52–54 Mēs arī pētījām izdalīšanos apstākļos, kas atdarina plazmas apstākļus (fosfātu buferšķīdums [PBS). ] buferšķīdums, pH 7,4).

Plazmas apstākļos tikai aptuveni 1,5% Tesa izdalās pēc 48 stundām, un mazāk nekā 20% Tesa izdalās līdz 25. dienai, kas liecina par konjugāta plazmas stabilitāti (3.B attēls).

Lizosomālos apstākļos apmēram 60% Tesa tiek atbrīvoti no D-Tesa pirmo 48 stundu laikā, un 19 dienu laikā gandrīz 100% Tesa tiek atbrīvoti. Šie rezultāti parāda, ka D-Tesa nodrošina ilgstošu, aktivizētu brīvo zāļu izdalīšanos pirmajās divās nedēļās, ko inkubē fizioloģiski nozīmīgos, lizosomālos apstākļos.

Turklāt minimālā Tesa izdalīšanās simulētās plazmas apstākļos (pH 7,4 grupā) pirmajās 48 stundās ir nozīmīga, jo tas ir tipiskais G4-PAMAM-OH cirkulācijas laiks pirms nieru klīrensa, iespējams, ka sominimālā Tesa izdalīsies no konjugāti pirms tie sasniedz mikrogliju.24

D-Tesa samazināja M1 marķieru ekspresiju un palielināja M2 marķierus

Lai novērtētu D-Tesa spēju izraisīt M1 uz M2 fenotipa maiņu, mēs novērtējām D-Tesa spēju mainīt M1 un M2 marķieru ekspresiju in vitro, izmantojot peles mikroglia šūnu līniju (BV2).

BV2 šūnas tika izveidotas, iemūžinot peles mikroglia šūnas, un tika pierādīts, ka tās ir piemērota alternatīva primārajām mikroglia šūnām, lai pētītu mikroglia iekaisuma reakciju.55,56 Mūsu eksperimentos, lai atdarinātu neiroinflammatorisko vidi, kas pastāv vairāku neiroloģisku slimību gadījumā, mēs iepriekš apstrādājām mikrogliju ar 100 ng ml−1 (300 endotoksīna vienības (EU) uz ml) LPS 3 stundas.

Pēc tam mēs kopā apstrādājām šūnas ar LPS un vai nu bezmaksas Tesa, vai D-Tesa 48 stundas, un pēc tam savācām paraugus. Mēs apstrādājām šūnas ar 1,5, 15 un 150 µM brīvo Tesa vai D-Tesa koncentrāciju, pamatojoties uz līdzvērtīgām zālēm.

MTT tests parādīja, ka brīvā Tesaor D-Tesa šajās koncentrācijās neizraisīja citotoksicitāti (S4† att.). Sākotnējais devas noteikšanas pētījums tika veikts ar Tesa un D-Tesa, lai noteiktu visefektīvāko Tesa un D-Tesa devu.

Apstrāde ar 1,5 un 15 µM brīvu Tesa un D-Tesadīdu nemaina slāpekļa oksīda vai TNF- sekrēciju, kā noteikts attiecīgi ar Griesa reaģentu un TNF-ELISA (S5† att.). Pamatojoties uz šiem rezultātiem, mēs neanalizējām šīs zemākās koncentrācijas mūsu qRT-PCR testos.

Daudzu neirodeģeneratīvu slimību gadījumā viena no galvenajām proinflammatoriskām M1 mikrogliju neirotoksiskām funkcijām ir to reaktīvo skābekļa sugu (piemēram, slāpekļa oksīda) sekrēcija, kas tieši nogalina neironus.57,58 Pēc tam tika postulēts, ka viena potenciāla terapeitiskā stratēģija būtu šo molekulu sekrēcijas samazināšana.

Mēs novērtējām D-Tesa spēju sasniegt šo efektu. Pēc LPS stimulācijas D-Tesa samazināja izdalītā slāpekļa oksīda un inducējamā slāpekļa oksīda sintāzes (iNOS) mRNS līmeni 3.7- reizes (p < 0,0001) un 2- reizes (p {{). 7}}.011), salīdzinot ar šūnām, kas apstrādātas tikai ar LPS (tikai LPS) (4.A un B attēls).

No otras puses, brīvā Tesa mērenāk samazināja izdalīto slāpekļa oksīdu (14- reizes, p=0,004) un neizraisīja būtisku iNOS mRNS ekspresijas samazināšanos (4.A un B att. ).

D-Tesa bija daudz efektīvāka nekā brīvais Tesain, kas nomāca slāpekļa oksīda sekrēciju. Tālāk, atkarībā no tā, vai mikroglijām ir M1 vai M2 fenotips, mikroglija paaugstina iNOS vai Arginase 1 (Arg1) regulēšanu, lai metabolizētu L-arginīnu, lai ražotu slāpekļa oksīdu M1 patogēnu nogalināšanas reakcijai, orornitīnu un urīnvielu M2 brūču dzīšanas reakcijai. 59

Saskaņā ar iNOS pazemināto regulējumu D-Tesa palielināja Arg1 mRNS līmeni 2- reizes (p=0,011), salīdzinot ar kontroli, kas satur tikai LPS, savukārt brīvā Tesa izteiksme būtiski nepalielināja (p=0). .40) (4.C att.).

D-Tesa un mazākā mērā brīvā Tesa nomainīja mikrogliju no citotoksiskā slāpekļa oksīda izdalīšanas uz L-arginīna metabolizēšanu brūču dzīšanai, kas samazina un, iespējams, novērš neirotoksicitāti, ko neirodeģenerācijā izraisa mikroglija. 5–7,10

iNOS un izdalītā slāpekļa oksīda līmeņa pazemināšanās ar D-Tesa apstrādi ir saistīta ar iepriekšējiem darbiem, kas pierādīja, ka PPAR dabiskais ligands (15-deoksi-Δ12,14-prostaglandīns J2) samazina iNOS un slāpekļa oksīda ekspresiju un sekrēciju ar LPS ārstētiem. primārā mikroglija.60

IL-10, IL-4 un TGF- 1 ir citokīni, ko izdala alternatīvi aktivēta M2 mikroglija, kas var izraisīt neiroprotektīvu, pretiekaisuma vidi smadzenēs.58,61,62Ceļā šajā nolūkā D-Tesa palielināja IL-105.5-reizi (p=0.011) un IL-4 8.2-reizi (p { {15}}.013), salīdzinot ar tikai LPS kontroli (4. D un E att.).

Free Tesa būtiski nepaaugstināja ne IL-10, ne IL-4 līmeni, lai gan vidējie rādītāji bija 1.7-reizi (p=0.066) un 2.{7} }reizi (p=0.11) augstāks, attiecīgi ar Tesa apstrādātām mikroglijām, salīdzinot ar tikai LPS kontroles grupām (4. D un E att.). Turklāt D-Tesa palielināja TGF- 1 2.3-reizi (p=0.015) un brīvā Tesa izteiksmi būtiski nemainīja (4. att. F).

Tādējādi D-Tesa inducē pretiekaisuma citokīnu sekrēciju pēc mikrogliju ārstēšanas ar LPS, kas var mazināt neirotoksisko, pro-iekaisuma vidi neirodeģeneratīvās slimībās.5–7,10

D-Tesa izraisīta M2-apakštipa marķieru izpausme

CD206, Ccl1 un TLR8 ir specifiski marķieri attiecīgi M2a, M2b un M2c mikrogliju apakštipiem.58 D-Tesa pārregulēta CD206 4. izteiksme.{{10 }}fold (p < 0,001), Ccl1 3.5-fold (p < 0,005) un TLR8 5-fold (p < 0,01), savukārt brīvā Tesa būtiski nepalielināja kāds no šiem trim marķieriem (5A–C att.).

Šie dati liecina, ka ar D-Tesa apstrādātas mikroglijas uzrāda būtisku visu trīs M2 apakštipu marķieru regulējumu, kas atbilst izpratnei, ka mikroglija ir plastmasa, nevis bināra. 63–65

M1/M2 nomenklatūra pārlieku vienkāršo to sarežģītību, ka mikroglija var pastāvēt aktivizācijas stāvokļu spektrā; šajā kontinuumā ir raksturoti trīs atšķirīgi M2 fenotipi (M2a, M2b un M2c), un D-Tesa inducē marķieru ekspresiju, kas atbilst katram no šiem stāvokļiem. 58, 61, 63, 66, 67 M2a mikroglijas ir saistītas ar palielinātu patogēnu fagocitozi. proteīnus, paaugstinot uztveršanas receptoru regulēšanu, audu atjaunošanos un pretiekaisuma iedarbību.

M2b mikroglija ir līdzīga M1 mikroglijai, jo tās ekspresē IL-1, TNF- un IL-6; tomēr M2b atšķiras no M1 mikroglijas ar to, ka tie ekspresē IL-10 augstā līmenī un samazina iNOS ekspresiju. M2b makrofāgi un mikroglia stimulē Th2 T-šūnas, kas liecina par vienu no M2b lomām, izraisot pretiekaisuma reakciju.

M2cmicroglia ir iesaistīti brūču dzīšanu, audu remodelāciju, dzelzs sekvestrāciju un STAT3 aktivāciju, kas samazina proinflammatorisku signālu pārraidi.58, 61, 63, 66Tesa PPAR aktivitāte stimulē uz priekšu vērstu cilpu, kā rezultātā palielinās PPAR un tā augšupceļu signālu proteīna (STAT6) ekspresija. kas abi ir M2a marķieri.58D-Tesa palielināja PPAR 2.3-reizi (p=0.0036)un STAT6 3.4- reizes (p < 0,001), savukārt brīvā Tesa palielinājās STAT6 1.8- reizes (p=0,011) bez būtiska PPAR izteiksmes pieauguma (1.58-pieaugums, p=0.17) (5D un E att.).

Paaugstināta STAT6 un PPAR ekspresija izraisa pretiekaisuma gēnu veidošanos un pro-iekaisuma signālu kavēšanu, inhibējot NF-κB aktivitāti. Tā kā M2a mikrogliju var izraisīt, apstrādājot mikrogliju ar IL-4, kas signalizē caur STAT6 un PPAR, šo divu pakārtoto signalizācijas proteīnu regulēšana var izraisīt M2a polarizāciju.

Mūsu pārbaudēs LPS aktivācija paaugstināja IL-6, TNF- un IL-1 līmeni, un ārstēšana ar D-Tesa vēl vairāk regulēja šo citokīnu ekspresiju (S6A–D† att.), kas, visticamāk, D-Tesa dēļ, kas inducē M2b fenotipu (5.B att.).

Free Tesapaaugstināja IL-6 ekspresiju un būtiski nemainīja TNF- un IL-1 izteiksmi (S6A–D† att.). Lai gan šos citokīnus izdala M1 mikroglija, M2b mikroglija arī ekspresē šos citokīnus.58,61 CD86 ir gan M1, gan M2b mikroglia marķieris, un tas palielinās, apstrādājot ar D-Tesa (S6E† att.).

Turklāt citokīnu signalizācijas (SOCS) nomācējs ir intracelulāro proteīnu saime, kas regulē mikrogliju fenotipisko polarizāciju, nomācot vairākus signalizācijas ceļus, ko aktivizē citokīni.69 SOCS1 ir viens no šīs ģimenes locekļiem, un ir pierādīts, ka tas inhibē LPS/TLR4. mediēta NF-κB un JAK2 signalizācija, tādējādi samazinot TNF-, IL-1 un IL-6 daudzumu, ko izdala M1 mikroglia, izmantojot LPS/TLR4 ceļu.

D-Tesa pārregulē SOCS1 ekspresiju, salīdzinot ar kontroli, kas satur tikai LPS (S6F† att.), kas liecina, ka IL-6, TNF- un IL-1 palielināšanās, ko uzrāda D-Tesa, varētu būt saistīta ar M2b fenotips, nevis LPS/TLR4, M{10}}inducējošā fenotipa uzlabošana.

Turklāt LPS signalizē caur TLR4 un, lai novērstu pārmērīgu šūnu aktivāciju, mikroglijām piemīt negatīvas atgriezeniskās saites mehānisms, kā rezultātā TLR4 aktivācija samazina TLR4.70 ekspresiju.

Ārstēšana ar bezmaksas Tesa un D-Tesa palielināja TLR4 līmeni attiecīgi 3.6- (p < 0.001) un 3.7- (p < 0,001) (Att. 5F), kas liecina, ka Tesa un D-Tesa mainīja tipisko LPS/TRL4 negatīvās atgriezeniskās saites signālu ceļu.

For more information:1950477648nn@gmail.com