Ciklopentanons nodrošina pretmelanoģenēzi un pretgrumbu aktivitātes B16F10 melanomas gadījumā

Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hee Jin Jung 1, A Kyoung Lee 1, 2, Yeo Jin Park 1, 2, Sanggwon Lee 1, 2, Dongwan Kang 1, 2, Young Suk Jung 1, 2, Hae Young Chung 1, 2 un Hyung Ryong Moon 1, 2,*

Abstract:Ultravioletā (UV) starojuma iedarbība ir galvenais ārējas ādas novecošanās cēlonis, kas izraisa ādas hiperpigmentāciju un grumbu veidošanos. Šajā pētījumā mēs pētījām (2E,5E)-2,5-bis(3-hidroksi-4-metoksibenzilidēn)ciklopentanona (BHCP) balinošo ietekmi uz B16F10 melanomu un tās anti- grumbu aktivitāte uz Hs27 fibroblastu šūnām. Tika konstatēts, ka BHCP spēcīgi inhibē tirozināzi ar 50 procentu inhibīcijas koncentrācijas (IC50) vērtībām 1,10 μM un 8,18 μM formikofenolāta (L-tirozīna) un difenolāzes (L-DOPA), un enzīmu kinētikas pētījums atklāja, ka BHCP ir konkurētspējīga tipa inhibitors. . Turklāt BHCP ievērojami inhibēja melanīna saturu un šūnu tirozināzes aktivitāti un pazemināja ar mikroftalmiju saistītā transkripcijas faktora (MITF), cAMP atbildes elementu saistošā (CREB) proteīna fosforilēto līmeni un melanocītu stimulējošā hormona (-MSH) izraisīto tirozināzi. B16F10 melanomas šūnas. Turklāt BHCP inhibēja p65 fosforilāciju un matricas metaloproteināžu (MMP-1, MMP-9, MMP-12 un MMP-13) ekspresiju Hs27 fibroblastos. stimulē ar UV starojumu.Tāpēc mūsu rezultāti liecina, ka BHCP var būt labs kandidāts ārstniecisko līdzekļu izstrādei slimībām, kas saistītas ar hiperpigmentāciju un grumbu veidošanos.

Atslēgvārdi: (2E,5E)-2,5-Bis(3-hidroksi-4-metoksibenzilidēn)ciklopentanons (BHCP); tirozināzes inhibitors;anti-melanoģenēze; pretgrumbu

Cistanche irpretgrumbu veidošanās.

1. Ievads

Ādas novecošanās ir sarežģīts un progresējošs process, kas izraisa funkcionālas un estētiskas izmaiņas ādā, par ko ir atbildīgi gan iekšējie, gan ārējie faktori [1]. Ārējo ādas novecošanos izraisa vides agresori, piemēram, ultravioletais (UV) starojums, stress vai smēķēšana. Tomēr to galvenokārt izraisa atkārtota saules UV iedarbība, ko sauc par fotonovecošanos. Ādas fotonovecošanos raksturo rupjas un dziļas grumbas, biezums, raupjums, dispigmentācija un histoloģiskas izmaiņas [2–4].

Tirozināze (EC 1.14.18.1), kas pazīstama arī kā polifenola oksidāze, ir viens no daudzfunkcionāliem varu saturošiem enzīmiem, kas iesaistīts melanīna sintēzē, un ir plaši sastopams dabā [5]. Tirozināze parasti atrodas lielākajā daļā mikroorganismu, augu, un dzīvnieki. Augos tirozināze iedarbojas, oksidējot monofenolus par difenoliem (mikofenolāta aktivitāte), un ir iesaistīta o-difenolu oksidēšanā par o-hinoniem (difenolāzes aktivitāte), kam seko hinonu oksidēšana tumši brūnos pigmentos [6].

Melanoģenēze ir L-tirozīna pārvēršanās par 3,4-dihidroksifenilalanīnu (L-DOPA), kā rezultātā L-DOPA tiek pārveidots par DOPA hinīnu [7]. Tādējādi tirozināzei ir svarīga loma melanīna ražošanā melanocītos, un tirozināzes inhibīcija ir pievilcīgs mērķis ar pigmentāciju saistītu traucējumu uzlabošanai un balinošu līdzekļu izstrādei [8, 9]. Melanīna sintēzi ierosina vairāki stimuli, piemēram, UV un ķīmiskas vielas, tostarp izobutilmetilksantīns (IBMX) un alfa-melanocītus stimulējošais hormons (-MSH). -MSH saistās ar savu receptoru melanokortīna 1 receptoru (MC1R), tādējādi palielinot citoplazmas cikliskā AMP (cAMP) līmeni. Paaugstināts cAMP līmenis aktivizē proteīnkināzi A (PKA), kas inducē ar mikroftalmiju saistītā transkripcijas faktora (MITF) ekspresiju, fosforilējot cAMP atbildes elementu saistošo proteīnu (CREB). MITF inducē tirozināzes, ar tirozināzi saistītā proteīna (TRP)-1 un TRP-2 ekspresiju, kas galu galā palielina melanīna sintēzi [10]. MITF tiek uzskatīts par melanoģenēzes atslēgas transkripcijas faktoru; tāpēc ir veikti daudzi pētījumi, lai kontrolētu MITF ekspresiju, lai kavētu melanoģenēzi [11].

Ir zināms, ka grumbu veidošanās ir cieši saistīta ar ādas ārpusšūnu matricas degradāciju, un UV starojums aktivizē kodolfaktoru-κB (NF-κB), tādējādi palielinot kolagēna fragmentācijas un matricas metaloproteināžu (MMP) veidošanos [2]. MMP ir no cinka atkarīgas endopeptidāzes, kas ir svarīgas ārpusšūnu matricas struktūras pārveidošanā ādā. Tāpēc pārmērīga kolagēna un matricas noārdīšanās, ko izraisa UV izraisīti MMP, ir raksturīga fotobojātas ādas pazīme, un MMP tiek izmantoti kā galvenais UV izraisītas fotonovecošanās, kā arī ādas iekaisuma marķieris [12].

Kurkumīnam līdzīgie diarilheptanoīda skeleta atvasinājumi ir bijuši, tostarp antioksidanti, ziņots par pretvēža darbību. karkass, tostarp (2E,5E)-2,5-bis(3-hidroksi-4-metoksibenzilidēns)ciklopentanons (BHCP) (1. attēls),uzrādīt plašu pretiekaisuma un pretmelanoģenēzes spektru, jo īpaši Leow et al. [19] ziņots par bioaktivitātēm un anti-tirozināzi [13–18] dibenzilidēn-ciklopentanonu 2014. gadā, kas varētu veicināt aizsargājošo iedarbību uz cilvēka osteosarkomu, regulējot Wnt/-kateninsignalizācijas ceļu. Tomēr BHCP anti-melanoģenēzes un pretgrumbu iedarbība joprojām ir jāatklāj, un tās darbības pamatā esošie molekulārie mehānismi vēl nav skaidri noteikti.

1. attēls. (2E,5E)-bis(3-hidroksi-4-metoksibenzilidēn)ciklopentanona (BHCP) struktūra.

Šajā pētījumā mēs pētījām BHCP pretmelanoģenēzes un pretgrumbu potenciālu un centāmies identificēt iesaistīto mehānismu, jo īpaši attiecībā uz melanīna saturu un šūnu tirozināzes aktivitāti, kas tika pētīti, izmantojot tirozināzes inhibīcijas testu un enzīmu kinētikas analīzi. Turklāt mēs parādījām, ka BHCP inhibē melanoģenēzi un grumbas, kas ir saistīta ar CREB / MITF / tirozināzes pazemināšanos -MSH inducētās B16F10 peles melanomas šūnās un p65 un MMP ekspresijas fosforilācijas inhibīciju UV izraisītos Hs27 cilvēka fibroblastos.

pūķa garšaugi cistanche

2. Rezultāti un diskusija

2.1. (2E,5E)-2,5-Bis(3-hidroksi-4-metoksibenzilidēn)ciklopentanona (BHCP) sintēze

{{0}}hidroksi-4-metoksibenzaldehīda (100 mg, 0,66 mmol, izovanilīns) un ciklopentanona (0,03 ml, 0,33) šķīdums mmol) 1 N HCl-etiķskābes šķīdumā (0,02 ml) maisīja 25 °C temperatūrā 2 stundas. Pēc 1 dienas nostāvēšanas reakcijas maisījumu apstrādāja ar aukstu ūdeni neliela daudzuma metanola klātbūtnē, filtrēja un mazgā ar aukstu ūdeni, lai iegūtu BHCP (65,9 mg) ar 56,9 procentu iznākumu. BHCP identificēja ar spektroskopiskām metodēm, t.sk. 1H un 13C-KMR, kā arī salīdzinot ar publicētajiem spektrālajiem datiem un plānslāņa hromatogrāfijas (TLC) analīzi [19]. Struktūra ir parādīta 1. attēlā.

BHCP: dzeltens amorfs pulveris (CHCl3); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) 8: 9,25 (s, 2H, 2 × OH), 7,28 (s, 2H, 2xvinilH), 7,14 (d, 2H) , J=2.0 Hz, 2 × 2-H), 7,11 (dd, 2H, J=8,5, 2,0 Hz, 2 × 6- H), 7,01 (d, 2H, J=8,5 Hz, 2 × 5-H), 3,81 (s, 6H, 2 × OMe), 3,01 (s, 4H, 2 × CH2) ; 13C-KMR (100 MHz, DMSO-d6) 8: 195,5, 149,9, 147,2, 136,0, 133,1, 129,1, 124,3, 117,5, 112,8, 56,3, 26,6; ESI-MS: m/z 351 (M-H)-.

2.2. BHCP inhibējošā ietekme uz sēņu tirozināzes aktivitāti

Kā parādīts 1. tabulā, BHCP inhibēja tirozināzi ar IC50 vērtībām 1,10 ± 0,12 μMand 8,18 ± 0,44 μM, turpretim kojskābei (pozitīvā kontrole) IC50 vērtības bija 18,68 ± 3,8 ± 1,40 ± 1,8 μ. μM attiecīgi monofenolāzei un difenolāzei. Iepriekšējā pētījumā par sintētiskajiem potenciālajiem tirozināzes inhibitoriem, izmantojot molekulārās modelēšanas pētījumus, mēs atklājām mehānismu, ar kuru benzilidēna 3-hidroksi un 4-metoksigrupām bija liela saistīšanās tendence ar tirozināzes aktīvo vietu [20]. No šī pētījuma rezultāta tika parādīts, ka tā funkcionālās grupas (3-hidroksi un 4-metoksigrupas) bija saistītas ar ievērojamu tirozīnazes inhibējošās aktivitātes pieaugumu.

1. tabula. BHCP tirozināzes inhibējošā aktivitāte un enzīmu kinētiskā analīze.

Turklāt mehānisms, kas ir atbildīgs par BHCP izraisīto tirozināzes inhibīciju, šajā pētījumā tika pētīts, izmantojot enzīmu kinētisko analīzi (1. tabula un 2. attēls). Lineweaver-Burk diagrammas tika veidotas, izmantojot datus, kas iegūti no kinētiskiem pētījumiem, un inhibīcijas konstante (Ki) tika iegūta no Diksona diagrammām. Lineweaver–Burk dubultās savstarpējās diagrammas norādīja uz konkurētspējīga tipa inhibīciju. Kā parādīts 2.a–c attēlā, BHCP darbojās kā konkurējošs gan L-tirozīna, gan L-DOPA inhibitors. Turklāt Diksona diagrammu x-ass pārtvērumi parasti ir izmanto, lai noteiktu enzīmu inhibīcijas konstantes (Ki) enzīma-inhibitora kompleksam [21,22], kur thex ass vērtība norāda –Ki vērtību. Kā parādīts 2.b–d attēlā, BHCP Ki vērtības bija attiecīgi 1, 7 μMand 10, 5 μM kā substrāti L-tirozīnam un L-DOPA. Tā kā Ki vērtība apzīmē koncentrāciju, kas nepieciešama, lai izveidotu enzīmu-inhibitoru kompleksu, zemāka Ki vērtība liecina par efektīvāku inhibīciju pret tirozināzi.

2. attēls. Lineweaver-Burk (a, c) un Dixon (b, d) diagrammas tirozināzes enzīma inhibīcijai ar BHCP.

2.3. BHCP ietekme uz B16F10 melanomas un Hs27 fibroblastu šūnu dzīvotspēju

Pirms noteikt, vai BHCP iedarbojas pret melanoģenēzi un pretgrumbām, mēs pārbaudījām BHCP citotoksicitāti pret B16F10 šūnām un Hs27 šūnām, apstrādājot ar dažādām BHCP koncentrācijām dažādos laika intervālos, un šūnu dzīvotspēja tika mērīta ar EZ-Cytox testu. Kā parādīts 3.a, b attēlā, līdz 10 μM BHCP 48 stundas nesamazināja ne B16F10 šūnu, ne Hs27 šūnu izdzīvošanu. Pēc tam tika veikti turpmāki in vitro pētījumi par BHCP pretmelanoģenēzes un pretgrumbu aktivitātēm ar 1, 5 un 10 μM.

2.4. BHCP inhibīcija pret melanīna saturu un šūnu tirozināzes aktivitāti B16F10 melanomas šūnās

Lai noteiktu, vai BHCP inhibē melanīna saturu -MSH izraisītās B16F10 šūnās, šūnas tika iepriekš apstrādātas ar norādītajām dažādām BHCP vai kojskābes (5 mM) koncentrācijām (1, 5 un 10 μM) 24 stundas un pēc tam stimulētas. ar -MSH 48 stundas. Kā parādīts 4.a attēlā, melanīna saturs šūnās, kas apstrādātas ar BHCP -MSH klātbūtnē, samazinājās atkarībā no koncentrācijas, uzrādot par 113 procentiem pie 1 μM, 106 procentiem pie 5 μM un 102 procentiem pie 10 μM, salīdzinot ar kontroles grupa tika ārstēta tikai ar -MSH (186 procenti). Interesanti, ka BHCP (1 μM) inhibēja melanīna saturu spēcīgāk nekā kojskābe (5 mM). Turklāt tika veikts šūnu tirozināzes aktivitātes tests, lai izmērītu BHCP inhibējošo iedarbību uz B16F10 šūnām. Kā parādīts 4.b attēlā, BHCP samazinājās no koncentrācijas atkarīgā veidā ar tirozināzes aktivitāti par 120 procentiem pie 1 μM, 116 procentiem pie 5 μM un 105 procentiem pie 10 μM, salīdzinot ar kontroles grupu, kas tika ārstēta tikai ar -MSH (181). procenti ).BHCP inhibējošā iedarbība bija daudz spēcīgāka nekā kojskābei; BHCP inhibīcija pie 1 μM bija labāka par kojskābes inhibīciju pie 5 mM (131 procents). Šie rezultāti liecina, ka BHCP ir balinošs efekts, inhibējot melanīna biosintēzi un intracelulāro tirozināzes sintēzi B16F10 melanocītos.

4. attēls. BHCP melanīna satura (a) un šūnu tirozināzes aktivitātes (b) inhibīcija uz B16F10 melanomas šūnām.

2.5. BHCP ietekme uz MITF/tirozināzes un fosforilētā CREB ekspresiju B16F10 šūnās

MITF, specifisks transkripcijas faktors, spēlē galveno lomu melanogēno gēnu, tostarp tirozināzes, efektīvā aktivizēšanā, katalizē melanīna biosintēzes ātrumu ierobežojošo posmu: TRP-1 un TRP-2. MITF izpausme varētu var palielināties ar CREB fosforilēšanu [23]. CREB ir svarīgs MITF promotors [24, 25], un CREB fosforilēšana melanocītos palielina MITF ekspresiju, saistoties ar CREB (c-AMP atbildes elementu saistošo proteīnu) melanocītos [26]. Lai noskaidrotu molekulāros ceļus, kas ir atbildīgi par BHCP anti-melanogēno iedarbību uz B16F10 šūnām, mēs pārbaudījām galveno molekulu, tostarp CREB un MITF, olbaltumvielu līmeni, kam ir svarīga loma melanoģenēzē, izmantojot Western blot analīzi. Šūnas tika apstrādātas ar BHCP vai kojskābi un pēc tam stimulētas ar -MSH 48 stundas. Mērījumu laika intervāls atbilst iepriekšējos pētījumos aprakstītajai metodoloģijai [27]. Kā parādīts 5. attēlā, tirozināzes un MITF līmenis palielinājās ar -MSH, bet BHCP samazināja šo olbaltumvielu līmeni. Turklāt BHCP ievērojami nomāca CREB fosforilāciju. Ir zināms, ka -MSH izraisītas CREB fosforilācijas regulēšana ir potenciāli svarīga pigmentācijas regulēšanā [28]. Šie rezultāti liecina, ka BHCP anti-melanogēnā iedarbība rodas no MITF un tirozināzes pazemināšanās, samazinot fosforilētā CREB regulēšanu. Šis pētījums liecina, ka BHCP tirozināzes un melanoģenēzes inhibīcijas mehānisma noskaidrošana ir ļoti svarīga, un tā ir jāturpina pētīt nākotnē. Lai gan B16F10 melanomas šūnu līnija parasti ir piemērotāka signalizācijas mehānismu izpētei in vitro, B16F10 šūnu līnija ir no grauzēju melanomas. Tāpēc, lai apstiprinātu konstatējumus, būs nepieciešami turpmāki pētījumi par cilvēka melanocītiem.

2.6. BHCP ietekme uz UV izraisītu NF-κB p-p65 aktivāciju Hs27 šūnās

Pēc tam mēs pētījām BHCP ietekmi uz UV izraisītu iekaisuma mediatoru ekspresiju, izmantojot Hs27 fibroblastus. Iepriekš tika ziņots, ka p65 (Ser536) fosforilācija ir būtiska tā spējai transaktivēt gēnus [29]. Tāpēc p-p65 (Ser536) un p65 proteīna līmenis tika pārbaudīts kodola frakcijā ar Western blot metodi. Kā norādīts 6.a, b attēlā, Hs27 šūnās UV paaugstināja p-p65 (Ser536) proteīna līmeni kodolā, savukārt BHCP ārstēšana samazināja kodola p-p65 (Ser536) proteīna līmeni. Attiecīgi kopējais p65 daudzums citoplazmā tika samazināts ar UV un atjaunots ar BHCP (6.c, d attēls). Lai gan pēc UV indukcijas p65 proteīna ekspresijas līmenis samazinājās citoplazmā un palielinājās kodolā, pirmapstrāde ar BHCP mainīja šīs tendences atkarībā no devas. Tādējādi šie rezultāti liecina, ka p-p65 inhibīcija ar BHCP var veicināt aizsargājošo iedarbību uz ādas pigmentāciju un kolagēna iznīcināšanu pret UV.

6. attēls. BHCP ietekme uz p-p65 (Ser536) ekspresijas līmeņiem UV inducētās Hs27 cilvēka fibroblastu šūnās.

2.7. BHCP ietekme uz MMP ekspresiju Hs27 šūnās

MMP ir būtiska loma ādas novecošanā. UV starojums maina ādas saistaudus, regulējot MMP ekspresiju [30,31]. MMP-1 ir kolagēnu noārdošs enzīms, kas paātrina no I tipa prokolagēna sintezētā kolagēna sadalīšanos. MMP-9 ir želatīnu noārdošs enzīms, kas noārda kolagēna šķiedras, ko sagriež MMP-1, palielinot grumbu veidošanos un elastības zudumu. Lai pārbaudītu BHCP pretgrumbu iedarbību pret UV indukciju, mēs noteicām MMP-1 un MMP-9 proteīna līmeni ar Western blot metodi. Turklāt UV inducētās šūnas uzrādīja ievērojami paaugstinātu MMP-13 līmeni, kas ierosina I un III tipa kolagēna degradāciju, nevis MMP-1 [32]. Mēs pētījām MMP (MMP1, MMP9, MMP12 un MMP13) pieaugumu pēc UV inducētu Hs27 šūnu apstrādes ar BHCP pie 1 un 10 μM. Kā parādīts 7. attēlā, MMP-1, MMP-9, MMP-12 un MMP-13 ekspresijas līmenis palielinājās pēc UV indukcijas; tomēr BHCP terapija samazināja ekspresiju devā. -atkarīgs veids. Mūsu rezultāti liecina, ka BHCP var palīdzēt novērst grumbu veidošanos, samazinot UV iedarbības izraisīto MMP patoloģisku veidošanos. Šie rezultāti liecina, ka BHCP kavē MMP ekspresiju Hs27fibroblastos, lai novērstu kolagēna sadalīšanos un tādējādi grumbu veidošanos. Tāpēc BHCP ir potenciāls izmantot kā ar ādu saistītu slimību profilakses un ārstēšanas līdzekli.

cistanche kāta priekšrocības

3. Materiāls un metodes

3.1. Ķīmiskās vielas un instrumenti

Sēņu tirozināze (EC 1.14.18.1), -MSH, L-tirozīns, 3,4-dihidroksifenilalanīns (L-DOPA), dimetilsulfoksīds (DMSO) un kojskābe tika iegādāti no Sigma-Aldrich (Sentluisas, MO, ASV). Dulbecco modificētā Eagle barotne (DMEM), liellopu augļa serums, streptomicīns un amfotericīns tika iegādāti no Gibco Life Technologies Inc. (Karlsbāda, Kalifornija, ASV). Antivielas pret MITF, CREB, p-CREB, p-p65 (Ser536), p65, tirozināzi, MMP-1, MMP-9, MMP-12, MMP-13, TFIIB , un -actin tika iegādāti no Santa Cruz Biotechnology (Santakrusa, CA, ASV). Polivinilidēna difluorīda (PVDF) membrānas tika iegūtas no Millipore Corporation (Bedforda, MA, ASV). Sterileplastiskie izstrādājumi audu kultūrām tika iegādāti no SPL Labware (Seula, Koreja). UV gaismas avotu nodrošināja Crosslinker 800 sērijas (UVP, CA, ASV) 6 spuldžu bloks (8 vati uz lampu). Plānslāņa hromatogrāfija un silikagela 60 (230–400 tīkls) tika veikta uz silikagelaF{{27} }iepriekš pārklātas plāksnes no Merck Millipore (Darmštate, Vācija). KMR spektri tika reģistrēti, izmantojot Varian Unity INOVA 400 (400 MHz 1H, 100 MHz 13C) un Varian Unity AS 500 (500 MHz 1H) instrumentus. Ķīmiskās nobīdes vērtības (δ) ir norādītas, atsaucoties uz attiecīgajiem šķīdinātāja atlikuma vai deuterētajiem maksimumiem (δH 2,50 un δC 39,51 DMSO). Zemas izšķirtspējas masas spektrometrijas dati tika iegūti ar Expression CMS masas spektrometru (Advion, Ithaca, NY, ASV).

3.2. Sēņu tirozināzes inhibīcijas tests

Sēņu tirozināzes inhibējošā aktivitāte tika noteikta, izmantojot gan L-tirozīna, gan L-DOPA substrātus, pamatojoties uz procedūru, ko aprakstīja Jung et al. [23]. Īsumā, savienojumu klātbūtnē vai bez tiem (galīgā koncentrācija no 1 līdz 20 μM, izšķīdināts 100 procenti DMSO) katrā 96-iedobes plāksnes iedobē, lai nodrošinātu 200 μL galīgo tilpumu. Plāksni inkubēja 37 °C temperatūrā 30 minūtes. Tirozināzes aktivitāte tika kvantitatīvi noteikta, mērot absorbciju pie 492 nm, izmantojot mikroplašu lasītāju (TECAN, Zalcburga, Austrija), un procentuālo inhibīcija (procenti) tika iegūta no šāda vienādojuma:

procentuālā inhibīcija=(Ac – As)/Ac × 100 (1)

kur Ac ir kontroles absorbcija un As ir parauga absorbcija. IC50 vērtības tika aprēķinātas no log-lineārajām līknēm un to vienādojumiem. Tiek parādīti trīs noteikšanu vidējie rezultāti. Kojicskābe tika izmantota kā pozitīva kontrole.

3.3. Tirozināzes inhibīcijas kinētiskā analīze

Lai noteiktu kinētiskos mehānismus, tika izmantotas divas kinētiskās metodes (Lineweaver-Burk un Dixon diagrammas) [21, 22, 33]. Lineweaver-Burk dubultā abpusējā diagrammā (grafiks 1/enzīma ātrums (1/V) pret 1/substrāta koncentrāciju (1/[S])) inhibīcijas veids tika noteikts, izmantojot dažādas L-tirozīna koncentrācijas (1, 2, un 4 mM) un L-DOPA (0,5, 1 un 2 mM) kā substrātus dažādu BHCP koncentrāciju klātbūtnē. BHCP koncentrācijas bija šādas: 0, 0.5, 1.{{20}} un 2.0 μM L-tirozīnam; un 0, 2,5, 5 un 10 μM L-DOPA. Diksona diagramma ir grafiska metode (1/enzīma ātruma (1/V) diagramma pret inhibitora koncentrāciju (I)) enzīma inhibīcijas veida noteikšanai, un to izmantoja, lai noteiktu disociācijas konstanti vai Ki fermenta-inhibitora kompleksam. Inhibīcijas Diksona diagrammas (atsevišķas savstarpējas diagrammas) tika iegūtas, klātesot L-tirozīna substrātam pie 1, 2 un 4 mM un {{40}}, 0.5, 1.{101} {47}} un 2.{49}} μM BHCP; un L-DOPA substrāts pie {{50}},5, 1.0 un 2,0 mM un 0, 2,5, 5,0 un 10,0 μM BHCP.

cistanche augsir tirozināzes inhibitors.

3.4. Šūnu līnijas un šūnu kultūra

Peles B16F10 melanomas šūnas tika iegūtas no Korejas šūnu līnijas bankas. Cilvēka ādas fibroblastu šūnu līnija Hs27 tika iegādāta no American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, ASV). Šīs šūnas tika turētas DMEM, kas papildināts ar 10 procentiem liellopu augļa seruma, 100 U/ml penicilīna un 100 mg/ml streptomicīna mitrinātā 5 procentu CO2 inkubatorā 37 ◦C. Ādas fibroblasti uz 100 mm šķīvja tika apstrādāti ar BHCP un pakļauti 50 mJ/cm2UV DMEM bez seruma (UV gaismas avots, UVP). Hs27 šūnas tika kultivētas līdz 70–80 procentiem saplūšanas 100 mm diametra plāksnē un tika izmantotas starp pasāžas numuriem 5 un 15.

3.5. Šūnu dzīvotspējas tests

Šūnu dzīvotspēja tika novērtēta, izmantojot EZ-Cytox komplekta testu. Īsāk sakot, B16F10 šūnas un Hs27fibroblasti tika iesēti 96-iedobes plāksnē ar blīvumu 1 × 104 šūnas/iedobē un inkubētas 37 ◦ C temperatūrā 24 stundas. Šūnas tika barotas ar svaigu, serumu nesaturošu DMEM, kas satur dažādas BHCP koncentrācijas (0, 1, 2, 5 un 10 μM), un inkubēja 24 un 48 stundas. Pēc tam katrā iedobē tika ievietots 10 μL EZ-Cytox šķīduma un šūnas tika inkubētas 2–4 stundas. Šūnu absorbcijas mērījums bez ārstēšanas tika uzskatīts par 100 procentu šūnu izdzīvošanu. Katra apstrāde tika veikta trīs reizes, un katrs eksperiments tika atkārtots trīs reizes.

3.6. Melanīna satura noteikšana

BHCP ietekme uz -MSH izraisītu melanoģenēzi B16F10 šūnās tika balstīta uz iepriekš izmantotu metodi ar nelielām modifikācijām [34]. Īsumā, B16F10 šūnām (5 × 104 šūnas/iedobē) 6-iedobes plāksnēs tika atļauts augt līdz 70–80 procentu saplūšanai. Pēc tam šūnas 24 stundas apstrādāja ar dažādu koncentrāciju BHCP (1, 5 un 10 μM) vai kojskābi (5 mM) un pēc tam 48 stundas stimulēja ar -MSH (5 μM). Pēc apstrādes šūnas divas reizes nomazgāja ar ledusaukstu PBS, izšķīdināja 90 μL 1 M NaOH šķīdumā, ieskaitot DMSO (5 procenti) 60 ◦ C temperatūrā 1 stundu, un absorbciju mēra pie 405 nm ar mikroplates spektrofotometru (TECAN, Zalcburga). , Austrija). Lai izmērītu melanīna daudzumu eksperimentā, inhibīcijas ātrums apstrādes grupās tika aprēķināts no zināmo sintētiskā melanīna koncentrāciju absorbcijas, kas tika koriģēta uz kopējo olbaltumvielu daudzumu, kas atradās šūnu lizātu supernatantā. Neapstrādātu šūnu absorbcija tika mērīta trīs eksemplāros.

3.7. Šūnu tirozināzes aktivitātes tests

Šūnu tirozināzes aktivitātes tests tika veikts, mērot L-DOPA oksidācijas ātrumu [35]. B16F10 šūnas ar blīvumu 5 × 104 uz šūnām tika ievietotas 6-iedobju trauciņos un inkubētas pa nakti. Pēc tam šūnas 24 stundas apstrādāja ar dažādu koncentrāciju BHCP (1, 5 un 10 μM) vai kojskābi (5 mM) un pēc tam 48 stundas stimulēja ar -MSH (5 μM). Šūnas tika mazgātas ar PBS un lizētas šķīdumā, kas satur 100 μL 50 mM fosfāta buferšķīduma (pH 6,5), 0,1 mM fenilmetilsulfonilfluorīda (PMSF) un 1 procentu Triton X-100. Pēc tam šūnas 30 minūtes ievietoja dziļās saldēšanas mašīnā (-80 ◦C). Pēc šūnu atkausēšanas šūnu ekstrakti tika attīrīti, centrifugējot ar ātrumu 12, 000 apgr./min 30 minūtes 4 ◦C temperatūrā. Pavisam 80 μL supernatanta un 20 μL L-DOPA (2 mg/mL) tika pievienoti 96-iedobes plāksnei, un absorbcija pie viļņa garuma 492 nm tika mērīta ik pēc 10 minūtēm 1 stundu 37 ◦. C ar ELISA plākšņu lasītāju (TECAN, Zalcburga, Austrija).

3.8. Hs27 šūnu citozola un kodola ekstraktu sagatavošana

Hs27 šūnas tika mazgātas ar ledus aukstu PBS un novāktas. Citosola frakciju ekstrakcijai tika izmantots buferšķīdums, kas satur 10 mM Tris(pH 8.0), 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,1% NP-40 un proteāzes inhibitorus. centrifugēšana pie 12, 000 apgr./min 4 ◦C 15 minūtes, un kodola frakcijas tika ekstrahētas no granulām, izmantojot buferšķīdumu, kas satur 10 mM Tris, 50 mM KCl, 100 mM NaCl un proteāzes inhibitorus, inkubēja uz ledus 30 minūtes, un pēc tam centrifugēja pie 13,000 × g 30 minūtes 4 ◦C temperatūrā, lai iegūtu kodolfrakcijas.

3.9. Western blotēšana

Lizāta paraugus 10 minūti vārīja gēla iekraušanas buferšķīdumā (125 mM Tris-HCl, 4% nātrija dodecilsulfāta (SDS), 10% 2-merkaptoetanola un 0,2% bromfenola). zils; pH 6,8) tilpuma attiecībā 1:1. Kopējie proteīna ekvivalenti katram paraugam tika atdalīti ar SDS-poliakrilamīda gēlelektroforēzi (PAGE), izmantojot akrilamīda gelus, pamatojoties uz Laemmli [36] aprakstīto procedūru, un pārnesti uz PVDF membrānām pie 80 V 2 stundas, izmantojot mitrās pārneses sistēmu. Membrānas nekavējoties tika ievietotas bloķējošā buferšķīdumā (5 procenti beztauku piena) 10 mM Tris, pH 7,5, 100 mMNaCl un 0,1 procenti Tween{25}}. Bloti tika bloķēti, lai novērstu nespecifisku saistīšanos 25 ◦ C temperatūrā 2 stundas. Pēc tam membrānas nakti inkubēja ar specifisku primāro antivielu 4 ◦ C temperatūrā, kam sekoja inkubācija ar mārrutku peroksidāzi konjugētu sekundāro antivielu 25 ◦ C 1 stundu. . Antivielu marķēšana tika noteikta ar pastiprinātu ķīmisko luminiscenci saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Olbaltumvielu kvantitatīvā noteikšana tika veikta, izmantojot Davinch-Chemi TM.Chemiluminescence Imaging System CAS-400SM (Core Bio, Seula, Korea). Molekulmasas noteikšanai tika izmantoti iepriekš iekrāsoti proteīna marķieri.

3.10. Statistiskā analīze

Visi dati ir parādīti kā vidēji ± SEM. Dati tika analizēti ar vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA), lai noteiktu atšķirības starp ārstēšanu, kam sekoja Bonferroni post-hoc tests. Vērtība p < 0,05="" tika="" uzskatīta="" par="" statistiski="">

4. Secinājumi

Kopumā šī pētījuma rezultāti parādīja, ka BHCP ir ādu balinoša iedarbība, inhibējot tirozināzi, kas ir galvenais enzīms melanīna biosintēzei -MSH inducētos B16F10 melanocītos. Turklāt BHCP samazināja MMP proteīna līmeņa ekspresiju UV inducētos fibroblastos, kam ir paredzams pretgrumbu efekts. Ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai apstiprinātu BHCP balinošo un pretgrumbu iedarbību, izmantojot dzīvnieku un klīniskos pētījumus. Visbeidzot, tika konstatēts, ka BHCP ir gan balinošs, gan pretgrumbu efekts, norādot uz tā potenciālu terapeitisko līdzekļu attīstībā slimībām, kas saistītas ar hiperpigmentāciju un grumbu veidošanos.

kas ir cistanche

Lai iegūtu plašāku informāciju, lūdzu, noklikšķiniet šeit.