Dendrimera-tesaglitazara konjugāts izraisa mikroglia fenotipa maiņu un pastiprina amiloido fagocitozi† 1. daļa

Mikroglijas pārslēgšana no slimību paasinoša, “iekaisuma” stāvokļa uz neiroprotektīvu, “pretiekaisuma” fenotipu ir daudzsološa stratēģija vairāku neirodeģeneratīvu slimību risināšanai.

Mikroglijas ir centrālās nervu sistēmas šūnu veids, kas galvenokārt ir atbildīgs par neironu veselības un darbības uzturēšanu. Tie var izdalīt dažādus augšanas faktorus un neirotrofiskus faktorus un var uzturēt normālu neironu vielmaiņas aktivitāti, attīrot atkritumus ap neironiem. Pēdējos gados veiktie pētījumi liecina, ka mikroglija ir cieši saistīta ar atmiņu. Apskatīsim to kopā.

Pirmkārt, mikroglija var stimulēt neironus un veicināt neironu aktivāciju, tādējādi uzlabojot atmiņu. Atbrīvojot virkni neirotransmiteru, piemēram, glutamātu un alanīnu, mikroglija var veicināt signāla pārraidi starp neironiem un var uzlabot glia-neironu signāla rezonansi starp presinaptiskajām membrānām, vēl vairāk veicinot neironu uzbudināmību un atmiņas veidošanos.

Otrkārt, mikroglija var arī iztīrīt atkritumus ap neironiem, uzturēt normālu neironu vielmaiņas aktivitāti un samazināt neironu mirstību, tādējādi veicinot atmiņas uzlabošanos. Ja ap neironiem uzkrājas pārāk daudz atkritumu, tas ietekmēs neironu normālu vielmaiņas aktivitāti, izraisot neironu nāvi un pavājinātu funkciju, tādējādi samazinot atmiņas veiktspēju. Microglia var uzturēt normālu neironu vielmaiņas vidi un samazināt neironu mirstību, absorbējot un sadalot apkārtējos atkritumus, tādējādi uzlabojot atmiņu.

Rezumējot, mikroglia ir cieši saistīta ar atmiņu. Veicinot neironu uzbudinājumu un attīrot apkārtējos atkritumus, mikroglija var vēl vairāk uzlabot atmiņu un uzturēt mūsu smadzenes veselas un aktīvas. Mums vajadzētu pievērst uzmanību mikroglia veselības aizsardzībai, lai panāktu labāku atmiņu. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa, un Cistanche var ievērojami uzlabot atmiņu, jo Cistanche ir tradicionāls ķīniešu ārstniecības materiāls ar daudziem unikāliem efektiem, no kuriem viens ir atmiņas uzlabošana. Cistanche efektivitāti nodrošina dažādas tajā esošās aktīvās sastāvdaļas, tostarp miecskābe, polisaharīdi, flavonoīdu glikozīdi utt. Šīs sastāvdaļas var veicināt smadzeņu veselību dažādos veidos.

Noklikšķiniet uz zināt 10 veidus, kā uzlabot atmiņu

Proinflammatoriskās mikroglijas veicina slimības progresēšanu, atbrīvojot neirotoksiskas vielas un paātrinot patogēno proteīnu uzkrāšanos. Ir pierādīts, ka gan PPAR, gan PPAR agonisti pārvērš mikrogliju no pro-iekaisuma (“M1-līdzīgs”) uz alternatīvi aktivētu (“M2-līdzīgu”) fenotipu. Šādas stratēģijas ir pētītas neiroloģisko slimību, piemēram, Alcheimera un Parkinsona slimības, klīniskajos pētījumos, taču tās, visticamāk, ir bijušas neveiksmīgas to sliktās asins-smadzeņu barjeras (BBB) ​​iespiešanās dēļ.

Ir pierādīts, ka ar hidroksilgaldu saistīti poliamidoamīna dendrimēri (bez mērķligandu pievienošanas) šķērso bojāto BBB neiroiekaisuma vietā un uzkrājas aktivētās mikroglijās.

Tāpēc PPAR / dubultā agonista dendrimera konjugācija var nodrošināt mērķtiecīgu aktivētās mikroglijas fenotipa maiņu. Šeit mēs iepazīstinām ar jauna dendrimera-PPAR / dubultā agonista konjugāta (D-tesaglitazar) sintēzi un raksturojumu.

In vitro D-tesaglitazars izraisa "M1 uz M2" fenotipa maiņu, samazina reaktīvo skābekļa sugu sekrēciju, palielina fagocitozes gēnu ekspresiju un patogēno proteīnu (piemēram, -amiloīda, -sinukleīna) enzīmu noārdīšanos un palielina amiloido fagocitozi.

Šie rezultāti atbalsta tālāku D-tesaglitazara attīstību, lai to varētu izmantot vairāku neirodeģeneratīvu slimību, īpaši Alcheimera un Parkinsona slimību, ārstēšanai.

Ievads

Amerikas Savienotajās Valstīs vien pašlaik ir vairāk nekā 5,3 miljoni cilvēku ar Alcheimera slimību (AD) un 1 miljons cilvēku ar Parkinsona slimību (PD).1 Tā kā vecuma palielināšanās ir lielākais daudzu neirodeģeneratīvu slimību riska faktors, šo slimību izplatība un ārstēšanas izmaksas. turpinās pieaugt, jo iedzīvotāju skaits turpinās pieaugt.

Turklāt neseno panākumu trūkums jaunu zāļu izstrādē šo slimību ārstēšanai ir parādījis nepieciešamību izstrādāt inovatīvus terapijas veidus.2,3 Šīs klīniskās neveiksmes norāda uz grūtībām zāļu izstrādē, tostarp nogādājot smadzenēs pietiekami augstu zāļu koncentrāciju, lai tās būtu efektīvas bez izraisot nelabvēlīgas blakusparādības.

Neirodeģeneratīvām slimībām, piemēram, AD un PD, ir trīs galvenās neiropatoloģiskas sastāvdaļas: neiroiekaisumi, patogēnu proteīnu uzkrāšanās un neironu nāve.4–7 Veseliem cilvēkiem, iedzimta smadzeņu imūnšūna (temikroglija) pastāvīgi fagocitizē nepareizi salocītus proteīnus (piemēram, -amiloīdu, -sinukleīnu). ), kas to ražošanas laikā izraisa neironu nāvi, kas neļauj veidoties raksturīgiem agregātiem.

Tomēr cilvēkiem, kuriem galu galā attīstās neirodeģeneratīvas slimības, mikroglija vairs efektīvi neizņem šīs olbaltumvielas un pāriet uz slimību paasinošu, iekaisumu veicinošu fenotipu (parasti apzīmēts kā M1).

Lai gan galvenokārt pro-iekaisuma/pretiekaisuma (M1/M2) mikroglia aktivācijas klasifikācija ir pārmērīga makrofāgu polarizācijas spektra vienkāršošana, tā joprojām tiek izmantota kā plaša nomenklatūra, lai aprakstītu dominējošo mikroglia fenotipu neiroiekaisumā un atbildē uz terapiju.

M1-līdzīgi mikrogliji atbrīvo reaktīvās skābekļa sugas un citus iekaisuma mediatorus, kas gan izraisa neironālu nāvi, gan saasina slimības patoloģiju, palielinot patogēno proteīnu (piemēram, -amiloīda, -sinukleīna) veidošanos.

Turklāt galvenie ģenētiskie riska faktori AD (TREM2 un APOE) attīstībai ir izteikti augstā līmenī mikroglijā, un ir pierādīts, ka TREM2/APOE ceļš izraisa amikroglia fenotipa maiņu AD, amiotrofisko laterālo sklerozi (ALS) un multiplo sklerozi. dzīvnieku modeļi.8

Šie atklājumi vēl vairāk parāda mikroglia lomu vairāku cilvēka neirodeģeneratīvu slimību patoloģijā. Pieeja, lai manipulētu ar mikroglia fenotipu, ļautu pētniekiem izprast to lomu neirodeģeneratīvās slimībās, papildus potenciāli efektīvai terapijai.

Mikroglijas maiņa no M1 uz pretiekaisuma un neiroprotektīvu (M2) fenotipu ir ierosināta kā terapeitiska stratēģija vairāku neirodeģeneratīvu slimību ārstēšanai.5,6 Ir pierādīts, ka divi pašlaik FDA apstiprināti PPAR agonisti – II tipa diabēta zāles rosiglitazons un pioglitazons M1 uz M2 fenotipu maiņa makrofāgos un mikroglijās in vitro un in vivo.

Ir pierādīts, ka 9,10 PPAR agonisti samazina LPS izraisīto reaktīvo skābekļa sugu sekrēciju, samazinot NF-κB aktivitāti, izraisot NF-κB noārdīšanos un izvešanu no kodola, kā arī no ligandu atkarīgu transrepresiju.

Turklāt epidemioloģiskie pētījumi ir parādījuši, ka diabēta pacientiem, kuri lieto rosiglitazonu vai pioglitazonu, ir samazināts AD un PD attīstības risks.12 Pēc tam rosiglitazons un pioglitazons tika pētīti AD III fāzes klīniskajos pētījumos, bet neizdevās.13

Viens no iespējamiem iepriekšminēto klīnisko pētījumu neveiksmes izskaidrojumiem ir šo zāļu vājā transportēšana caur hematoencefālisko barjeru (BBB), tādējādi ierobežojot to zāļu skaitu, kuras sasniedz šajos klīniskajos pētījumos iesaistīto pacientu smadzenes.14

Patiešām, tiek lēsts, ka BBB neļauj aptuveni 98% no visām mazo molekulu zālēm sasniegt smadzenes, un tikai daļa no smadzenēs nonākušajām zālēm sasniedz mikrogliju.15

Turklāt PPAR ir vēl viens kodolreceptors PPAR saimē.16 Tam ir nozīme lipīdu homeostāzē un iekaisuma regulēšanā, un ir pierādīts, ka PPAR agonistiem ir arī pretiekaisuma iedarbība mikroglijā.

Klīniskie pētījumi, izmantojot neiroattēlu, pēcnāves audu analīzi un CSF biomarķierus, ir pierādījuši, ka BBB ir traucēta AD un PD, kā arī citu neirodeģeneratīvu slimību gadījumā.

Ir pierādīts, ka 17 paaudzes -4 hidroksilterminālie poliamidoamīna (G4-PAMAM-OH) dendrimēri pēc sistēmiskas ievadīšanas vairākos dažādos neiro-iekaisuma slimību modeļos pēc būtības apiet traucēto BBB un uzkrājas aktivētās mikroglijās bez mērķa ligandiem. , tostarp grauzējiem, trušiem, suņiem un primātiem, kas nav cilvēkveidīgie primāti.18–28 Zīmīgi, ka G4-PAMAM-OH var ievadīt sistēmiski un šķērsot BBB slimības modeļos ar viegliem BBB traucējumiem, piemēram, Reta sindromu.29

Turklāt G4-PAMAM-OH uzņemšanas apjoms smadzenēs ir tieši proporcionāls slimības smagumam cerebrālās triekas trušu modelī.30 Dendrimeriem ar hidroksilgaldu ir priekšrocība, ka tie tiek piegādāti neinvazīvi, salīdzinot ar ļoti invazīvu, lokālu piegādi caur galvaskauss, kas nepieciešams iepriekšējos pētījumos ar citām nanodaļiņām, piemēram, poli-εkaprolaktonu un PEG, negatīvi lādētiem PAMAM dendrimeriem, kvantu punktiem un nanoformulācijām, kas sastāv no polietilēnimīna (PEI) un dekstrāna sulfāta.31–35

Turklāt šie hidroksil-PAMAM dendrimeri ir ideāli novietoti tulkošanai to mērogojamības un labi panesamā in vivo drošības profila dēļ.36–38 Pozitīvu pirmsklīnisko efektivitātes datu dēļ a (G4-PAMAM-OH)-N- acetilcisteīna konjugāts pašlaik tiek novērtēts agrīnos klīniskajos pētījumos saistībā ar bērnu smadzeņu adrenoleukodistrofiju (NCT03500627) un smagu koronavīrusa slimību 2019 (COVID-19) saistītu iekaisumu (NCT04458298).

Mēs pētījām tesaglitazara (Tesa) dendrimēra un zāļu konjugātu, kas pievienots -4 paaudzes PAMAMdendrimeram ar hidroksilgrupu. Tesaglitazar ir spēcīgs PPAR/dubultais agonists, kas apvieno PPAR un PPAR agonistu labvēlīgo iedarbību. Tas satur karbonskābes funkcionālo grupu kovalentai konjugācijai ar dendrimēru un sekojošai atbrīvošanai.

Papildu ģitāras ir izstrādātas un klīniski pārbaudītas, taču Tesa tika izvēlēta, jo tā ir lielāka PPAR un PPAR aktivitātes attiecība, salīdzinoši vienkārša ķīmiskā struktūra un drošības profils.39–43

Tesa iepriekš ir sasniegusi III fāzes klīniskos pētījumus par 2. tipa cukura diabētu Amerikas Savienotajās Valstīs, bet neizdevās no devas atkarīgas toksicitātes dēļ, ko var novērst, samazinot nepieciešamo ievadīšanas devu ar kontrolētu dendrimeru.39,40,44Tā kā Tesa ir PPAR / dubultais agonists, tā mērķtiecīga ievadīšana aktivētajā mikroglijā neiroiekaisuma vietā varētu būt ļoti labvēlīga.

Šeit mēs demonstrējam dendrimera-tesaglitazara konjugāta (D-Tesa) sintēzi un raksturojumu un demonstrējam šī savienojuma spēju izraisīt "M1 uz M2" fenotipa maiņu mikroglijā un uzlabot fluorescējoši iezīmēta amiloīda fagocitozi.

Materiāli un metodes

Materiāli

1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilkarbodiimīda metioīds (EDC), 4(dimetilamino)piridīns (DMAP), CuSO4·5H2O, nātrija askorbāts, heksinskābe un liellopu seruma albumīns (BSA) tika iegādāti no Sigma Aldrich US un tika izmantoti pēc saņemšanas (St Louis, MO).

Tesaglitazars tika iegūts no AstaTech Inc. (Bristole, PA). Etilēndiamīna kodola PAMAM dendrimers (4. paaudze ar 64 hidroksilgrupām) tika saņemts no Dendritech Inc. (Midlenda, MI) kā metanola šķīdums.

Dendrimers tika uzglabāts metanolā 4 grādu temperatūrā, un pirms lietošanas metanols tika iztvaicēts. Dialīzes membrāna ar molekulmasas robežvērtību (MWCO) 1 kDa tika iegādāta no Spectrum Laboratories Inc. (Ņūbrunsvika, NJ).

Visi citi šķīdinātāji tika izmantoti bezūdens formā. Visas reakcijas, izņemot vara (I), katalizētās alkīna-azīda cikloaddīcijas (CuAAC) klikšķa reakcijas, tika veiktas bezūdens apstākļos organiskā vidē ar krāsnī žāvētiem stikla traukiem inertā slāpekļa atmosfērā. atmosfēra.

Šūnu kultūrai: Dulbecco modificētā ērgļa barotne (DMEM), liellopu augļa sēne (FBS), penicilīns-streptomicīns (P/S), 0,05% tripsīna-EDTA un MTT reaģents tika iegūti no Invitrogen (Carlsbad, CA). , ASV).

Griesa reaģents tika iegūts no Promega (Madison, WI), un TNF-ELISA tika iegūts no R&D Systems (Mineapolisa, MN). Analītiskās kvalitātes metanols tika iegādāts no Sigma-Aldrich. Tripāna zils tika iegūts no Corning (Manassas, VA, ASV).

Sintēzes procedūras D-Tesa konjugātiem
Tetraetilēnglikola monoazīds (2) tika sintezēts, izmantojot iepriekš publicētu protokolu.45

Tesa-TEG-azīda sintēze un attīrīšana (3).
Tesa (950 mg, 2,32 mmol) tika izšķīdināts 10 ml dimetilformamīda (DMF). Šim maisītajam šķīdumam pilienu veidā pievienoja tetrametilēnglikola monoazīdu (2, 662,1 mg, 3,02 mmol) DMF (1 ml). Pēc tam reakcijas maisījumam pievienoja DMAP (255,4 mg, 2,09 mmol) un EDC (577,5 mg, 3,02 mmol), un to 24 stundas maisīja ar slāpekļa attīrīšanu istabas temperatūrā.

Reakcija tika uzraudzīta, izmantojot plānslāņa hromatogrāfiju un augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju (HPLC). Reakcijas maisījumu atšķaidīja ar 100 ml dihlormetāna (DCM) un neattīrītu reakcijas maisījumu ievietoja dalāmajā piltuvē, un pēc tam organisko slāni trīs reizes mazgā ar piesātinātu nātrija bikarbonāta šķīdumu, kam sekoja piesātināts amonija hlorīda šķīdums un visbeidzot ar sālījumu.

Pēc tam organisko slāni žāvē ar bezūdens nātrija sulfātu. Šķīdinātājs organiskajā slānī tika noņemts, izmantojot rotācijas iztvaicētāju, un šķīdums tika atkārtoti izšķīdināts 3 ml DCM un absorbēts uz silikagela, lai to attīrītu ar CombiFlash® hromatogrāfijas sistēmu, izmantojot gradienta metodi ar etilacetātu/heksānu kā šķīdinātāju, lai iegūtu 3 kā dzidru. - dzeltenā eļļa.

Vēlamais, tīrs produkts tiek eluēts pie aptuveni 30–40% etilacetāta. (Ieražība: 70%). 1H KMR (500 MHz, CDCl3) 8 7,27 (d, J=8,6 Hz, 2H), 7,15 (d, J=1,9 Hz, 2H), 7,08 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,73 (d, J=8,6 Hz, 2H), 4,25–4,14 (m, 2H), 4,07 (t, J {{ 33}},8 Hz, 2H), 3,94 (dd, J =7,8, 5,2 Hz, 1H), 3,67–3,47 (m, 14H), 3,30 (dd, J=8,7) , 3,8 Hz, 2H), 3,06 (s, 3H), 3,02 (t, J=6,7 Hz, 2H), 2,91–2,84 (m, 2H), 1,08 (t, J=7 0,0 Hz, 3H). ESI-MS: teorētiskais C28H39N3O10S: 609,24, iegūts (M + 1): 610,13.

D-YNE sintēze un attīrīšana (5).

(480 mg, 4,22 mmol) tika pievienots maisītajam G4-PAMAM-OH (2,5 g, 0,176 mmol) šķīdumam 20 ml bezūdens DMF. Šim maisījumam pievienoja DMAP (430 mg, 3,52 mmol) un EDC (1 g, 5,28 mmol).

Reakcijas maisījumu 24 stundas maisīja ar slāpekli istabas temperatūrā. Kad reakcija bija pabeigta, reakcijas maisījumu pārnesa uz 1000 MWCO dialīzes cauruli. DMF dialīze tika veikta 24 stundas, un DMF tika mainīts apmēram ik pēc sešām stundām.

Pēc tam 24 stundas tika veikta dialīze ar dejonizētu (DI) ūdeni, ūdeni mainot apmēram ik pēc sešām stundām. Visbeidzot, iegūtā dialīzes mēģenes saturs tika liofilizēts 48 stundas, iegūstot baltu, pūkainu pulveri. (Ieražība: 61%). dendrimera virsma OH), 4,01 (t,esteris –CH2), 3,32 (m, dendrimers –CH2), 3,06 (m, dendrimera saistītājs –CH2), 2,85–2,58 (m, dendrimērs –CH2), 2,56–1,89 (m, dendrimērs un linkeris –CH2), 1,78–1,61 (m, linkeris –CH2).D-Tesa sintēze un attīrīšana (6).

Tesa-TEG-azīds (3177,8 mg, 0,3{{10}}3 mmol) tika pievienots maisījumam D-YNE(5, 35{{2{{27}). }}} mg, 0,023 mmol) 5 ml tetrahidrofurāna (THF) un ūdens 1:1 maisījuma ar 0,5 ml DMF mikroviļņu reaktoram drošā 20 ml flakonā. CuAAC klikšķa reakcijai reakcijas maisījumam tika pievienots vara sulfāta pentahidrāts (11,6 mg, 0,0467 mmol) un (+)-nātrija-laskorbāts (9,3 mg, 0,0467 mmol).

Flakons tika noslēgts, un reakcijas trauks tika ievietots Biotage® Initiator mikroviļņu reaktorā un reaģēts 20 W mikroviļņu starojumā, maisot 8 stundas 50 grādos. Reakcijas maisījumu pārnesa uz 1000 MWCO dialīzes cauruli, un DMF dialīze tika veikta 24 stundas, DMF aizstājot ar svaigu šķīdinātāju aptuveni ik pēc 4 stundām.

Pēc tam dialīzes mēģenes saturs tika pārnests uz afalcon mēģeni un pievienots ekvivalents daudzums DI ūdens. Turklāt piekūna mēģenes saturam tika pievienots 200 µl etilēndiamīntetraetiķskābes dinātrija sāls šķīduma.

Pēc tam šo maisījumu ievietoja jaunā 1000 MWCO dializatorā un 12 stundas veica dialīzi 1000 ml DI ūdens, pievienojot EDTA šķīdumu, kam sekoja ūdens dialīze 12 stundas.

Pēc tam maisījumu liofilizēja 48 stundas, un rezultātā izveidojās balts, pūkains pulveris. (Ieražība: 64%). 1H KMR (500 MHz, DMSO) δ 8,2–7,6 (m, dendrimera iekšējais amīds H), 7,36 (d, Tesa ArH), 7,21 (d, Tesa ArH), 7,03 (d, TesaArH), 6,76 (d, Tesa ArH), 4,37 (s, Tesa H), 4,18–4,04 (m, saistītājsH), 3,96 (dd, Tesa un saistītājs H), 3,70 (m, Tesa un saistītājs H) ,3,58–3,14 (m, dendrimērs –CH2), 3,14–2.86 (m, dendrimērs – CH2), 2,87–2,49 (m, dendrimērs un linkeris –CH2), 2,25 (m, dendrimērs –CH2) , 1,82–1,67 (m, saistītājs –CH2), 0,97 (t, Tesa –CH3).

Raksturošanas tehnikas

Kodolmagnētiskā rezonanse (KMR). KMR spektri tika reģistrēti ar Bruker 500 MHz spektrometru istabas temperatūrā. Protonu ķīmiskās nobīdes (δ) ir norādītas ppm.

1H KMR tika izmantots, lai noteiktu Tesa molekulu skaitu, kas pievienotas katrai D-Tesa molekulai ar protonu integrācijas metodi, salīdzinot dendrimera iekšējo amīda protonu maksimumus pie δ 7,6–8,2 ppm ar Tesa aromātiskajiem protoniem pie δ 7,36–6,76 metilprotonns. Tesa alifātiskajā reģionā.Augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfija (HPLC).

Tika izmantots HPLC (Waters Corporation, Milford, Masačūsetsa), kas aprīkots ar 1525 bināro sūkni, In-Line degazētāju AF, 717 plus automātisko paraugu ņemšanas ierīci, 2998 fotodiožu matricas detektoru un 2475 vairāku λ fluorescences detektoru, kas savienots ar Waters Empower programmatūru.

Tika izmantota Symmetry C18 apgrieztās fāzes kolonna (Tosoh, Japāna), kuras daļiņu izmērs ir 5 μm, garums 25 cm un iekšējais diametrs 4,6 mm. Savienojumi tika uzraudzīti pie 210 nm un 254 nm, izmantojot PDA detektorus.

Šķīdinātājs A mazgāja HPLC kvalitātes ūdeni ar 0,1% trifluoretiķskābi (TFA), un šķīdinātājs B bija acetonitrils (ACN) ar 5% ūdens un 0,1% TFA. Izmantotā metode sākās ar 1{ {7}}0 : 0 (ACN: ūdens), samazinājies līdz 10:90 (ūdens: ACN) 5 minūtēs, saglabājis šo polaritāti 15 minūtes un atgriezies uz 100:0 (ACN: ūdens) pēc 5 minūtēm. minūtes. Plūsmas ātrums tika uzturēts pie 1 ml min−1.Masas spektroskopija.

ESI-MS tika veikta ar BrukermicroTOF-II masas spektrometru, izmantojot acetonitrilu/ūdeni (9:1) kā šķīdinātāju sistēmu. Lai apstiprinātu empīrisko formulu, tika izmantoti molekulārie joni kā protonēti maksimumi [M + nH] n+ vai adukti [M + nX] n+ (X=Na, K vai NH4).

Dinamiskā gaismas izkliede un ζ-potenciāls. Daļiņu izmēra un ζ-potenciāla sadalījuma noteikšanai tika izmantots Zetasizer NanoZS (Malvern Instrument Ltd, Worchester, UK), kas aprīkots ar 50 mW He-Ne lāzeru (633 nm). D-Tesa tika izšķīdināts DI ūdenī līdz koncentrācijai 0,2 mg ml-1 DLS un 10 mM nātrija hlorīda līdz koncentrācijai 0,1 mg ml-1 ζ potenciālam.

Mērījumi tika veikti 25 grādu leņķī, izmantojot 173 grādu izkliedes leņķi, kā aprakstīts iepriekš.27,46 Zāļu izdalīšanās pētījums. D-Tesa tika izšķīdināts koncentrācijā 1 mg ml-1 vai nu fosfāta buferšķīdumā (pH 7,4), kas imitēja plazmas apstākļus, vai nātrija citrāta šķīdumā (pH 5,5), lai atdarinātu lizosomu apstākļus.

Izdalīšanās pētījuma sākumā nātrija citrāta šķīdumam tika pievienotas esterāzes no cūku aknām (no Sigma Aldrich), un pētījuma laikā tās tika papildinātas aptuveni ik pēc 3 dienām.

Katrā flakonā bija 15 ml parauga, un eksperimenta laikā tos nepārtraukti krata 37 grādos. Dažādos laika punktos tika savākti dublikāti 200 µl paraugi no katra pH un pēc tam esterāzes aktivitāte tika apturēta, pievienojot 200 µl metanola. Nulles stundu laika punktu paraugi kalpoja kā kontrole.

Paraugi tika uzglabāti -80 grādu temperatūrā, lai turpmāk izvairītos no jebkādas hidrolīzes. Paraugus tālāk analizēja ar HPLC, un tika aprēķināts laukums zem līknes (pie 210 nm) brīvā zāļu maksimumam. Laukums zem līknes tika korelēts ar atbrīvoto zāļu daudzumu, izmantojot kalibrēšanas līkni, kurā zināmās brīvās Tesa koncentrācijas tika veiktas ar HPLC pie 210 nm.

For more information:1950477648nn@gmail.com