Uz KMR balstīta metaboliskā analīze ketoglutarāta papildinājuma ietekmei uz C2C12 mioblastiem dažādos enerģijas stāvokļos

Noklikšķiniet šeit, lai iegūtu Cistanche pretnovecošanās un noguruma piedevas

1. Ievads

Skeleta muskuļi ir lielākais orgāns cilvēka ķermenī un uztur normālu dzīvesveidu.Ilgstoša vingrošanas apmācībavai patoloģiskal slimību procesi izraisa muskuļu bojājumusvainepietiekama muskuļu enerģijas piegāde, šajā laikā īpaši svarīga ir muskuļu spēka un funkciju atjaunošana. Lai veicinātu skeleta muskuļu hipertrofiju un uzlabotu sportisko sniegumu, ir izmantoti dažādi uztura bagātinātāji [1]. Kā organiskā oglekļa un slāpekļa metabolisma krustpunkts un vienlaikus kritisks starpprodukts TCA ciklā -Ketoglutarāts (AKG) ir parādījis pleiotropisku iedarbību, lai uzlabotu muskuļu veiktspēju klīniskos un dzīvnieku eksperimentos [2–9]. Piemēram, AKG var samazināt zarnu gļotādas bojājumus [8] un iekaisumu [9], vājinātkolorektālā vēža attīstība[4] un aknu fibrozi [5], veicina augšanu [6] un samazina saslimstību unaizkavēt novecošanos[7]. Iepriekšējie darbi ir parādījuši, ka AKG papildināšana var mazināt muskuļu zudumu, parenterāli ievadot to pacientu traumas modelī, kam tiek veikta pilnīga gūžas locītavas protezēšana [2], un veicināt muskuļu hipertrofiju un proteīnu sintēzi, izmantojot Akt/mTOR signālu ceļus [10,11]. Diušena muskuļu distrofijas gadījumā AKG papildināšana var novērst muskuļu atrofiju un disfunkciju, izmantojot PHD3/ADRB{5}}mediēto ceļu [12]. Mūsu iepriekšējais darbs arī parādīja, ka AKG papildināšana var būtiski atvieglot C2C12 mioblastu proliferāciju un atvieglot C2C12 miocauruļu atrofiju, kas kultivēti bez glikozes barotnē [13]. Ņemot vērā, ka glikoze ir galvenais enerģijas avots, lai uzturētu normālas skeleta muskuļu fizioloģiskās funkcijas, AKG piedevu ietekme muskuļu darbības uzlabošanai ir lielā mērā atkarīga no glikozes līmeņa skeleta muskuļos. AKG izraisītās ietekmes atšķirības skeleta muskuļos starp dažādiem enerģijas stāvokļiem nav skaidras.

AKG piedalās aminoskābju, vitamīnu unorganiskās skābesunenerģijas metabolismsorganismā, kas ietver AKG pārvēršanu glutamātā ar glutamāta dehidrogenāzes palīdzību un sekojošu glutamāta amidēšanu ar amonjaku ar glutamīna sintetāzi. AKG nodrošina enerģiju šūnu augšanai, izmantojot TCA ciklu un oksidatīvo fosforilāciju, un veicina šūnu metabolismu un signālu pārraidi, mijiedarbojoties ar tā receptoru OXGR (ar G proteīnu saistītu receptoru) uz šūnu membrānas [14,15]. Turklāt AKG var regulēt mitohondriju oksidatīvo metabolismu un veicināt pieļaujamo epiģenētisko stāvokli, mediējot agrīnu embriju šūnu stāvokļa pāreju un dzimumšūnu attīstību [16]. Turklāt slodzes izraisīts AKG var stimulēt savu receptoru OXGR1 virsnieru dziedzeros, lai kontrolētu termoģenēzi un triglicerīdu sadalīšanos taukaudos un labvēlīgi ietekmētu vielmaiņu [17].

Tomēr ir veikti daži pētījumi, lai atklātu AKG izraisītās skeleta muskuļu vielmaiņas izmaiņas dažādos enerģijas stāvokļos un pamatā esošos metabolisma mehānismus. Nesen tika izmantota metabolomiskā analīze, lai sistemātiski noskaidrotu molekulāros mehānismus, kas ir uztura bagātinātāju labvēlīgās ietekmes pamatā. Metabolītu maiņas, kas darbojas kā gēnu transkripcijas pakārtotie produkti, var intuitīvi atspoguļot vispārējās vielmaiņas izmaiņas. Metabolisma analīzēs plaši izmantota augstas izšķirtspējas 1H kodolmagnētiskās rezonanses (NMR) spektroskopija kā īpaši piemērotas metodes metabolītu līmeņu izmaiņu kvantitatīvai noteikšanai biofluīdos, audos un šūnās. Būtiski, ka uz NMR balstītai metabolomiskajai profilēšanai ir vairākas priekšrocības, piemēram, augsta reproducējamība, kvantitatīvi mērījumi bez aizspriedumiem un ērta paraugu sagatavošana [18, 19]. Iepriekš mēs veicām uz NMR balstītas metabolomiskās analīzes, lai noskaidrotu gan kreatīna papildināšanas ietekmi uz C2C12 mioblastiem [20], gan alanilglutamīna papildināšanas ietekmi uz mioblastiem, kas ievainoti enerģijas trūkuma dēļ [21].

2. Rezultāti

2.1. C2C12 mioblastu proliferācija un diferenciācija ar AKG papildinājumu

C2C12 mioblastu šūnas, kas kultivētas normālā augšanas barotnē ar AKG papildinājumu un bez tās, tika grupētas kā Nor-A un Nor, savukārt augšanas barotnē ar zemu glikozes saturu ar vai bez AKG papildinājuma tika grupētas kā Low-A un Low. Saskaņā ar iepriekšējo pētījumu [10] Nor-A šūnām ar AKG papildinājumu 2 mm koncentrācijā bija ievērojami uzlabota šūnu dzīvotspēja salīdzinājumā ar Nor šūnām (S1 attēls).

Tāpēc eksperimentos, lai novērtētu AKG izraisītās izmaiņas mioblastu proliferācijā un diferenciācijā, tika izmantota AKG koncentrācija 2 mm. Salīdzinot ar Nor šūnām, Low šūnām bija ievērojami samazināts proliferācijas ātrums enerģijas deficīta dēļ (1.A attēls). Lai gan AKG papildināšana neizraisīja būtiski atšķirīgu mioblastu morfoloģiju abos enerģijas stāvokļos, tas ne tikai uzlaboja zemo šūnu proliferācijas ātrumu, kas kultivētas vidē ar zemu glikozes līmeni, bet arī uzlaboja Nor šūnu proliferācijas ātrumu, kas kultivētas normālā barotnē saskaņā ar iepriekšējie pētījumi [10,12]. Šūnu skaits noteiktā apgabalā tika skaitīts četrām mioblastu grupām (n=4 grupai): Nor, 563,8 ± 10,4; Nor-A, 624,0 ± 10,8; Zems, 493,8 ± 14,5; Zema A, 547,0 ± 11,7 (1.B attēls). Ir vērts atzīmēt, ka zemas A šūnas neuzrādīja statistiski atšķirīgu šūnu skaitu no Nor šūnām, norādot, ka AKG papildināšana varēja atgūt šūnu skaitu mioblastiem zemas glikozes kultūras apstākļos (1.B attēls).

1. attēls. C2C12 mioblastu proliferācijas un diferenciācijas spējas normālas un zemas kultūras apstākļos. glikozes kultūra. (A) Mioblastu morfoloģijas. (B) Šūnu numuri, kas atbilst panelim A (n=4). (C) Šūnu dzīvotspēja attiecībā pret Nor šūnām, kas analizēta ar MTS šūnu proliferācijas testu (n=5). (D) MyoD1 ekspresijas mioblastos, kas analizētas ar Western blot. Anti-GAPDH antiviela tika izmantota, lai standartizētu olbaltumvielu daudzumu katrā joslā. (E) Statistiskā analīze, kas atbilst paneļiem (D) (n=4). * p < 0.{{10}}5,** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

Turklāt tika veikts MTS tests, lai kvantitatīvi salīdzinātu četru šūnu grupu proliferācijas ātrumu (1.C attēls). Zemām šūnām bija izteikti samazināts proliferācijas ātrums, salīdzinot ar Nor šūnām, norādot, ka vide ar zemu glikozes līmeni nelabvēlīgi ietekmēja šūnu proliferāciju. Zīmīgi, ka AKG papildināšana uzlaboja Nor-A un Low-A šūnu proliferācijas ātrumu attiecīgi salīdzinājumā ar Nor un Low šūnām. Ņemiet vērā, ka zema A līmeņa šūnām bija zemāka proliferācijas spēja nekā Nor šūnām, kas nozīmē, ka AKG papildinājums tikai daļēji atjaunoja šūnu proliferāciju, kas kultivētas vidē ar zemu glikozes līmeni.

.Miogēnās diferenciācijas 1 (MyoD1) proteīna ekspresiju parasti izmanto, lai raksturotu šūnu diferenciācijas spēju. Tādējādi mēs kvantitatīvi salīdzinājām MyoD1 izpausmes starp četrām šūnu grupām (1D attēls). Zemām šūnām bija dziļi samazināta diferenciācijas spēja, salīdzinot ar Nor šūnām. Zīmīgi, ka AKG papildināšana regulēja šūnu diferenciācijas spējas, kas tika kultivētas gan normālā barotnē, gan barotnē ar zemu glikozes līmeni, par ko liecina MyoD1 ekspresijas pieaugums par aptuveni 30 procentiem Nor-A un Low-A šūnās. Proti, Low-A šūnas neuzrādīja statistiski nozīmīgi atšķirīgu MyoD1 ekspresiju no Nor šūnām, kas liecina par AKG papildinājuma augsto efektivitāti, lai atjaunotu šūnu diferenciācijas spēju, kas kultivētas vidē ar zemu glikozes saturu.

Turklāt mēs analizējām miotube diferenciācijas spējas četrām C2C12 mioblastu grupām. Miocaurules tika veidotas, sapludinot mioblastus, kas kultivēti normālā un zemas glikozes diferenciācijas barotnē ar vai bez AKG papildinājuma S3 attēls). C2C12 miocaurules morfoloģijas parādīja, ka zema glikozes līmeņa kultūra pasliktināja šūnu miotube diferenciācijas spēju, un AKG papildināšana var veicināt mioblastu diferenciāciju miocaurulēs, kas kultivēti gan normālā barotnē, gan zemā glikozes vidē.

2.2. C2C12 mioblastu ūdens ekstraktu KMR spektri

Tipiski 850 MHz 1H KMR spektri tika reģistrēti ūdens ekstraktiem, kas iegūti no C2C12 mioblastu Nor, Nor-A, Low un Low-A grupām (2.A attēls). Kopā tika piešķirti 34 metabolīti un apkopoti S1 tabulā. Metabolītu rezonanses piešķīrumi tika apstiprināti, izmantojot 2D 1H-13C HSOC un 1H-H TOCSY spektrus (S4 un S5 attēls). KMR spektru vizuālā pārbaude liecināja, ka mioblastu kultivēšana ar AKG papildinājumu izraisīja ievērojamu intracelulāro AKG uzkrāšanos Nor-A un Low-A šūnās (2.B attēls).

2. attēls. Vidējais 850 MHz lH kodolmagnētiskās rezonanses (NMR) spektrs, kas reģistrēts ūdens ekstraktos, kas iegūti no C2C12 mioblastu Nor, Nor-A, Low un Low-A grupām. (A) Četru grupu vidējo KMR spektru salīdzinājums. Vertikālās skalas tika saglabātas nemainīgas visos lH KMR spektros. Ūdens apgabals (4.{7}}.2 ppm) tika noņemts (B) Vietējie pastiprinātie a-ketoglutarāta (AKG) pīķu apgabali. Zila/zaļa/dzeltena/sarkana līnija: spektra apgabali no Nor/Nor-A/Low/Low-A grupām. AKG, a-ketoglutarāts; PC, O-fosfoholīns; GPC, sn-glicero-3-fosfoholīnaUDP-glikoze, uridīna difosfāta glikoze: CTP, sn-glicero-3-fosfoholīns; NAD plus , nikotīnamīda adenīna dinukleotīds AXP adenīna mono / di / trifosfāts.

2.3. Daudzfaktoru datu analīze šūnu vielmaiņas profilu izpētei

Tālāk mēs veicām daudzfaktoru datu analīzi par NMR spektrālajiem datiem četru C2C12 mioblastu grupu metabolisma profilēšanai. Vispirms mēs izveidojām trīs neuzraudzītus PCA modeļus ar pirmajiem diviem komponentiem (PC1, PC2), lai apskatītu grupēšanas tendences un atklātu vielmaiņas atšķirības starp mioblastu grupām. ThePCA punktu diagrammas parāda, ka zema glikozes barotnē kultivēto šūnu vielmaiņas profils skaidri atšķīrās no tā, kas kultivēts normālā barotnē (3.A attēls), un AKC papildināšana būtiski mainīja vielmaiņas modeļus šūnām, kas kultivētas gan normālā barotnē, gan vidē. vidē ar zemu glikozes saturu (3.B,C attēls). Tomēr vielmaiņas atšķirība starp Nor-A un Nor grupām bija lielāka nekā starp Low-A un Low grupām, kas nozīmē, ka AKG papildināšanas ietekme uz mioblastu vielmaiņas profilu ir lielā mērā atkarīga no šūnu enerģijas stāvokļa.

3. attēls. Daudzfaktoru analīzes 'HNMR spektriem tika reģistrētas ūdens ekstraktiem, kas iegūti no Nor, Nor-A, Low un Low-A grupu C2C12 mioblastiem. (AC) PCA vērtē zemo un nor grupu, zemo A un zemo grupu Nor-A un Nor grupu diagrammas; (DF) OPIS-DA vērtē zemo un nor grupu (R2: 0.999, 02: 0.996), zemo A un zemo grupu (R2: 0.918: 02: 0.761), Nor-A un Nor grupas (R2: 0,927: 02: 0,838). Elipses norāda 95 procentu ticamības robežu.

Turklāt mēs izveidojām trīs uzraudzītus OPLS-DA modeļus, lai ilustrētu vielmaiņas atdalīšanu starp četrām mioblastu grupām (3D-F attēls). Kā gaidīts, OPLSDA modeļi maksimāli palielināja vielmaiņas atšķirības starp četrām grupām, rezervējot korelēto ortogonālo mainīgo informāciju un filtrējot nekorelētu ortogonālo mainīgo informāciju. Turklāt mēs veicām izlases permutācijas testus (n=200), lai novērtētu OPLS-DA modeļu uzticamību (S6. attēls), kas norāda izveidoto OPLS-DA modeļu derīgumu.

2.4. Diferenciālo un svarīgo metabolītu identifikācijas

Lai kvantitatīvi salīdzinātu metabolītu līmeni starp četrām C2C12 mioblastu grupām, mēs aprēķinājām identificēto metabolītu relatīvos līmeņus, pamatojoties uz to relatīvajiem integrāļiem (S2 tabula). AKG papildināšana dramatiski palielināja intracelulāro AKG līmeni Nor-A un Low-A grupās, bet būtiski nemainīja līmeni Nor un Low grupā. Mēs veicām Stjudenta t-testu, lai identificētu atšķirīgos metabolītus ar kritēriju p < 0,05 (4. attēls). Nor vs. Low salīdzinājums identificēja 29 atšķirīgus metabolītus (4.A attēls), tostarp 18 pastiprinātus metabolītus (leicīnu, izoleicīnu, valīnu, acetātu, glutamātu, glutamīnu, metionīnu, aspartātu, lizīnu, kreatīnu, PC (O-fosfoholīns)taurīnu, tirozīnu , fenilalanīns, histidīns, NAD plus , formiāts, AXP) un 11 atteicās no Metabo. lites (glutations, piroglutamāts, fosfokreatīns, beta-alanīns, GPC, glikoze, glicīns, acetāts, treonīns, GTP, UDP-glikoze). Zema-A un zemi identificēto diferenciālo metabolītu salīdzinājums (4.B attēls), tostarp 7 palielināti metabolīti (etanols, AKGbeta-alanīns, PC, taurīns, glicīns un GTP) un 3 samazināti metabolīti (glutamīns, lizīns un mioinozitols). Nor-A un Nor salīdzinājums atklāja 18 atšķirīgus metabolītus (4.C attēls), tostarp 6 paaugstināti regulētus metabolītus (AKG, piroglutamātu, glutamīnu, lizīnu, glikozi, laktātu) un 12 samazinātus metabolītus (alanīnu, acetātu, glutationu). metionīns, fosfokreatīns, PC, mioinozitols, glicīns, treonīns, GTP, UDP-glikoze un AXP).

4. attēls. Atšķirīgo metabolītu relatīvā intensitāte tika noteikta, veicot pāru salīdzinājumu starp četrām C2C12 mioblastu grupām. (A) Zems pret nē; (B) zems A pret zemu; (C) Nor-A pret Nor. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.n { {13}} katrai grupai.

Turklāt mēs izmantojām OPLS-DA modeļus, lai identificētu svarīgus metabolītus ar kritēriju VIP> 1 (5. attēls). Kopumā tika identificēti 12, 10 un 10 svarīgi metabolīti no OPLS-DA modeļiem Nor-A vs. Nor, Nor vs. Low, Low-A vs. Low.

5. attēls. Svarīgo metabolītu VIP rādītāji tika noteikti, salīdzinot četras C2C12mioblastu grupas pāros. (A) Zems pret nē; (B) zems A pret zemu; (C) Nor-A pret Nor. Sarkans/zils fonts apzīmē paaugstinātu/samazinātu metabolīta līmeni.

Identificēto svarīgo metabolītu un atšķirīgo metabolītu kombinācija radīja raksturīgus metabolītus (1. tabula). Salīdzinājumi pa pāriem zemu un nor, zemu A un zemu un Nor-A un Nor identificēja attiecīgi 10, 6 un 10 raksturīgus metabolītus, norādot, ka AKG papildināšanas ietekme uz mioblastiem bija cieši saistīta ar enerģiju. šūnu stāvoklis.

2.5. Būtiski izmainīta vielmaiņas identifikācija

Ceļi Mēs veicām vielmaiņas ceļu analīzi, lai noteiktu būtiski izmainītus vielmaiņas ceļus (nozīmīgos ceļus), pamatojoties uz metabolītu līmeņiem, kas identificēti, veicot četru C1C12 mioblastu grupu pāru salīdzinājumu (S7 attēls; 2. tabula un S3 tabula). Nor vs. Low analīze identificēja 11 nozīmīgus ceļus: (1) alanīna, aspartāta un glutamāta metabolisms; (2) Glicīna, serīna un treonīna metabolisms; (3) Glutationa metabolisms; (4) D-glutamīna un D-glutamāta metabolisms; (5) Cietes un saharozes metabolisms; (6) beta-alanīna metabolisms; (7) Taurīna un hipotaurīna metabolisms; (8) Fenilalanīna metabolisms; (9) Fenilalanīna, tirozīna un triptofāna biosintēze; (10) Nikotināta un nikotīnamīda metabolisms; (11) Histidīna metabolisms. Šis nozīmīgais ceļš bija saistīts ar enerģijas metabolismu, oksidatīvo stresu un TCA cikla anaplerotisko plūsmu.

Nor-A un Nor analīze tikai identificēja pirmos piecus nozīmīgos ceļus 1–5, izņemot pārējos sešus ceļus 6–11. Atšķirībā no zemas-A un zemas analīzes tika identificēti tikai seši nozīmīgi ceļi: pirmie četri ceļi 1–4, kas koplietoti, salīdzinot Zemu un Nor, Nor-A un Nor; divi ceļi 6.–7., kas ir kopīgi, salīdzinot Zemu un Nor. Ņemiet vērā, ka AKG papildināšana būtiski nemainīja 5. ceļu (cietes un saharozes metabolisms) šūnās, kas kultivētas vidē ar zemu glikozes saturu, bet traucēja divus citus ceļus (beta-alanīna metabolismu un taurīna un hipotaurīna metabolismu). Lai vizualizētu AKG izraisītās izmaiņas raksturīgajos metabolītos, mēs projicējām šos metabolītus vielmaiņas kartē, pamatojoties uz Kioto gēnu un genomu enciklopēdijas (KEGG) datubāzi (6. attēls). KEGG ir plaši izmantots kā viens no galvenajiem datu resursiem, lai rekonstruētu vielmaiņas tīklus un izceltu nozīmīgus vielmaiņas ceļus. Gan mainītie raksturīgie metabolīti, gan būtiski mainītie vielmaiņas ceļi sniedz jaunu ieskatu molekulārajos mehānismos, kas ir pamatā AKG papildināšanas ietekmei uz C2C12 mioblastiem.