lai iegūtu plašāku informāciju:ali.ma@wecistanche.com

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai skatītu 2. daļu

Yasaman Alaghbanda,b,c, Janine L. Kwapisa,b,d, Alberto J. Lópeza,b,c, André O. Whitea,b,c,3, Osasumwen V. Aimiuwua,b,c,1, Amni Al- Kačaka,b,c,2, Kasuni K. Bodinayakea,b,c,

Nicole C. Oparaugoa,b,c, Richard Danga,b,d, Mariam Astarabadia,b,c,4, Dina P. Matheosa,b un Marselo A. Wooda,b,c,d

a301 Qureshey Research Lab, Neirobioloģijas un uzvedības nodaļa, Center for the

Mācīšanās neirobioloģija unAtmiņa, Kalifornijas Universitāte, Īrvina, Irvina, Kalifornija, 92697 mācīšanās un neirobioloģijas centriAtmiņa(CNLM), Irvine, Kalifornija, 92697 c

Ērvinas Atkarību neirozinātnes centrs (ICAN), Kalifornijas universitāte, Irvina, Kalifornija, 92697d Institute forAtmiņaTraucējumi un neiroloģiski traucējumi, Kalifornijas Universitāte, Ērvina,

Noklikšķiniet, laiCistanche tubulosa priekšrocības un blakusparādības atmiņas uzlabošanai

Abstrakts

Histona dezacetilāzes (HDAC) ir hromatīnu modificējoši enzīmi, kas tiek uzskatīti par spēcīgiem negatīviem regulatoriem.atmiņaprocesi. Ir pierādīts, ka HDAC3 ir galvenā loma ilgtermiņa atmiņā par objektu atrašanās vietu, kā arī ar kokaīnu saistītās izzušanasatmiņa, taču nav skaidrs, vai šī funkcija ir atkarīga no HDAC3 deacetilāzes domēna. Šeit mēs pārbaudījām, vai HDAC3 dezacetilāzes domēnam ir nozīme objekta atrašanās vietāatmiņaar kokaīnu saistītu atmiņu veidošanos un izzušanu. Izmantojot HDAC3 deacetilāzes mirušā punkta mutantu, mēs noskaidrojām, ka HDAC3 dezacetilāzes aktivitātes selektīva bloķēšana muguras hipokampā uzlaboja ilgtermiņa atmiņu objekta atrašanās vietai, bet neietekmēja ar kokaīnu saistītās atmiņas veidošanos. Kad šis pats HDAC3 punktveida mutants vīruss tika ievadīts prelimbiskajā garozā, tas nespēja ietekmēt ar kokaīnu saistītoatmiņaveidošanās. Attiecībā uz izzušanu HDAC3 dezacetilāzes domēna bojājums infralimbiskajā garozā neietekmēja izzušanu, bet tika novērots atvieglots ekstinkcijas efekts, kad punktveida mutanta vīruss tika nogādāts muguras hipokampā. Šie rezultāti liecina, ka HDAC3 dezacetilāzes domēnam ir selektīva loma konkrētos smadzeņu reģionos, kas ir ilgtermiņa pamatā.atmiņaobjekta atrašanās vietas veidošanās, kā arī ar kokaīnu saistītiatmiņaveidošanās un izzušana.

Atslēgvārdi

ilgstoša atmiņa; epigenētika; hromatīns; objekta atrašanās vieta; kondicionētas vietas izvēle; muguras hipokamps

Ievads

Histona acetilēšana ir labi izpētīts hromatīna modificēšanas mehānisms, kas iesaistīts gēnu ekspresijas regulēšanā, kas nepieciešamaatmiņa. Daudzi pētījumi ir parādījuši, ka histona acetilēšana ir iesaistīta ilgtermiņāatmiņaveidojums (egreviewed Levenson and Sweatt, 2006; McQuown un Wood, 2011; Gräffand Tsai, 2013; Peixoto un Abel, 2013; Penney un Tsai 2014). Histona acetilēšanu veic histona acetiltransferāzes un histona dezacetilāzes (HDAC), kas kopumā attiecīgi atvieglo un nomāc gēnu ekspresiju (Jenuwein un Allis 2001; Kouzarides, 2007). Histona dezacetilāze 3 (HDAC3) ir visizteiktākā I klases HDAC smadzenēs, un šis specifiskais HDAC ir spēcīgs negatīvs mācīšanās un atmiņas procesu regulators (Kwapis et al., 2017; Malvaez et al., 2013; McQuown et al. ., 2011; Rogge et al., 2013). Mūsu laboratorija ir parādījusi, ka HDAC3 ir izšķiroša loma objekta atrašanās vietas un ar bailēm saistītās atmiņas veidošanā (McQuown et al., 2011; Kwapis et al., 2017), izmantojot hipokampu un amigdala specifiskas HDAC3 manipulācijas. Mēs arī esam parādījuši, ka HDAC3 inhibīcija veicina narkotiku meklēšanas uzvedības izzušanu tādā veidā, kas bloķē atjaunošanu (Malvaez et al., 2013). Malvaez et al (2013) ekstinkcijas eksperimentos tika izmantots selektīvs HDAC3 inhibitors, kas tika ievadīts sistēmiski, tāpēc mēs nevarējām noteikt, kuri smadzeņu reģioni ir vissvarīgākie no HDAC{23}}atkarīgās ekstinkcijas modulācijas.

HDAC3 pašam ir spēcīga dezacetilāzes aktivitāte (Guenther et al., 2002; Lahm et al., 2007; Zhang et al., 2002), un tas asociējas ar HDAC4/HDAC5, mijiedarbojoties ar korepresora kodolreceptoru korepresoru (NCoR), lai veido funkcionālu, daudzproteīnu represoru kompleksu (Guenther et al., 2001; Fischle et al., 2002; Alenghat et al., 2008). Viena ideja ir tāda, ka šie daudzproteīnu kompleksi var būt nepieciešami deacetilēšanai, jo HDAC4 katalītiskā aktivitāte kanoniskajos acetil-lizīna substrātos ir maza vai nav (Lahm et al., 2007). Ir pierādīts, ka HDAC4 modulēatmiņaneatkarīgi no tā dezacetilāzes domēna (Sando et al., 2012). Ārpus mācību jomas unatmiņa, HDAC3-mediētā gēnu ekspresija citos audos ne vienmēr prasa HDAC3 enzīmu funkciju (Sun et al., 2013), kas liecina, ka, iespējams, atmiņas veidošanai HDAC3 dezacetilāzes aktivitāte var nebūt nepieciešama. Vēl nesen HDAC3 dezacetilāzes aktivitāte atmiņas veidošanā nebija tieši pārbaudīta. Kwapis un kolēģi (2017) pierādīja, ka HDAC3 fermentatīvā aktivitāte patiešām ir nepieciešama no amigdalas atkarīgām formām.atmiņaveidošanās.

Iepriekšējie pētījumi parādīja, ka HDAC3 inhibitora sistēmiska ievadīšana var veicināt gan objekta atrašanās vietas veidošanosatmiņa(OLM), kā arī kokaīna konteksta izzušanaatmiņa(Malvaez et al., 2013). Tomēr, vai objekta atrašanās vietai ir nepieciešama HDAC3 dezacetilāzes aktivitāteatmiņaOLM hipokampā un ar kokaīna kontekstu saistītās atmiņas izzušana infralimbiskajā garozā joprojām nav skaidra. Pašreizējā pētījumā mēs īpaši pievērsāmies HDAC3 dezacetilāzes aktivitātei no hipokampa atkarīgā atmiņas veidošanā, kā arī muguras hipokampā (DH), prelimbiskajā garozā (PrL) un infralimbiskajā garozā (IL) attiecībā uz iegūšanu un izzušanu. ar kokaīnu saistītas vietas izvēle vai ar kokaīnu saistīts kontekstsatmiņaprocesi.

Materiāli un metodes

Priekšmeti

Visas procedūras apstiprināja Kalifornijas Universitāte, Irvinas Institucionālā dzīvnieku aprūpes un lietošanas komiteja, un tās atbilst Nacionālo veselības institūtu vadlīnijām. Peles bija 8–12 nedēļas vecas, un tām bija ad libitum piekļuve pārtikai un ūdenim savos mājas būros ar 12 stundu gaismas/tumsas ciklu. Uzvedības pārbaude tika veikta cikla gaišajā daļā. AAV-HDAC3(Y298H)-v5 eksperimentiem subjekti bija pieauguši vīriešu dzimuma C57BL/6J peles. HDAC3 floksa dzēšanas eksperimentam Hdac3flox/flox un savvaļas tipa Hdac3 plus/pl metiena biedrenes tika uzturētas uz C57BL/6J fona (Mullican et al., 2011). Īsumā šīs peles tika ģenerētas Dr. Miča Lazara laboratorijā Pensilvānijas Universitātē (Filadelfija, PA) ar loxP vietām, kas atrodas blakus Hdac3 gēna 4. eksonam līdz 7. eksonam, kas ir reģions, kas nepieciešams fermenta katalītiskajai aktivitātei (Mullican et al. al., 2011).

Narkotikas

Kokaīns-HCl tika iegādāts no Sigma-Aldrich (St. Louis, Misūri, ASV) un izšķīdināts fizioloģiskā šķīdumā (0,9 procenti NaCl). Kokaīna-HCl izsaka kā sāls svaru. Kokaīna-CPP apmācībai iegūšanas eksperimentos kokaīns-HCl tika izšķīdināts līdz galīgajai koncentrācijai 0,5 mg/ml un ievadīts 10 ml/kg ķermeņa svara tilpumā, kā rezultātā gala deva bija 5 mg/kg. Kokaīna-CPP apmācībai ekstinkcijas eksperimentā kokaīns-HCl tika izšķīdināts līdz galīgajai koncentrācijai 2 mg/ml un ievadīts 10 ml/kg ķermeņa svara tilpumā, kā rezultātā gala deva bija 20 mg/kg. Kokaīns-HCl un sāls šķīdums tika ievadīti intraperitoneāli (ip).

Ķirurģija

Peles tika inducētas ar 4% izoflurāna skābeklī un tika uzturētas 1,5–2.0% līmenī operācijas laikā. Dzīvniekiem tika injicēts vai nu AAV-HDAC3(Y298H)-v5, vai AAV-EV (tukšs vektors) (Kwapis et al., 2017). DH eksperimentiem abpusēji tika ievadīts 1 µlofvīruss. Prelimbiskajam un infralimbiskajam eksperimentam 0,3 µl vīrusa tika ievadīti abpusēji. Lai apstiprinātu HDAC3 (Y298H) ekspresiju, tika izmantota imunofluorescence. Injekcijas adatas tika nolaistas līdz vēlamajām koordinātām ar ātrumu 0.2mm/15s. {{20}}min pēc mērķa dziļuma sasniegšanas vīruss tika injicēts ar ātrumu 6 µl/h. Pēc infūzijas injekciju adatas tika atstātas vietā 2-min, lai vīruss varētu izplatīties. Pēc tam inžektorus pacēla 0,1 mm un ļāva nostāvēties vēl vienu minūti, pēc tam tos lēnām izņēma (0,1 mm/15 s). Griezums tika sašūts, un pirms uzvedības pilnīgai vīrusa izpausmei tika dotas 2 nedēļas. Vīrusi tika ievadīti ar diviem 28 gabarīta infūzijiem (DH: 3 mm no centra līdz centram; PrL/IL: 0,8 mm no centra līdz centram), kas pievienoti PE50 caurulei un savienoti ar Hamiltona šļircēm. uzstādīts uz infūzijas sūkņiem. DH koordinātas bija: AP, -2,0 mm; ML, ±1,5 mm; DV, −1,5 mm attiecībā pret Bregmu. PrL koordinātas bija: AP plus 1,9 mm; ML, ±0,4 mm; DV, −2,2 mm attiecībā pret Bregmu. IL koordinātas bija: AP, plus 1,5; ML, ±0,4 mm; DV, −3,2 mm attiecībā pret Bregmu.

AAV ražošana

Savvaļas tipa HDAC3 tika pastiprināts no peles hipokampu cDNS un klonēts modificētā pAAV-IRES-hrGFP (Agilent), kontrolējot CMV promotoru un -globīna intronu. Lai izveidotu punktu mutāciju, tika izveidota viena nukleotīda aizstāšana eksonā 11, lai tirozīna vietā 298. aminoskābē radītu histidīna atlieku (plazmīda MW92). Empty Vector kontrolei HDAC3 kodējošās secības nebija, bet visi pārējie elementi paliek (plazmīda MW87). Adeno-saistīto vīrusu (AAV) izveidoja Penn Vector Core (Pensilvānijas Universitāte) no iepriekš aprakstītajām plazmīdām, un tas tika serotipizēts ar AAV 2.1. AAV-HDAC3 (Y298H) galīgais titrs bija 6, 48 × 1012 GC / ml, un AAV-EV galīgais titrs bija 1, 35 × 1013 GC / ml.

Imunofluorescence

Uzvedības eksperimentos, kas parādīti 2.–7. attēlā, katram dzīvniekam, kas iekļauts uzvedības analīzēs, tika veikta vīrusu infūzija, ko apstiprināja imūnhistoķīmija. Peles tika eitanāzētas ar dzemdes kakla dislokāciju, un to smadzenes tika izņemtas un ātri sasaldētas ledusaukstā izopentānā. 20µm šķēles tika savāktas visā IL/PrL vai DH, uzmontētas uz priekšmetstikliņiem un uzglabātas –80 grādu temperatūrā līdz lietošanai. Imunofluorescences analīzei priekšmetstikliņi tika fiksēti ar 4% paraformaldehīdu 10 minūtes un caurlaidīgi 0,01% Triton X-100 0,1M PBS 15 minūtes. Pēc tam priekšmetstikliņus 1 stundu istabas temperatūrā bloķēja 8% normālā kazas serumā (Džeksons) un nakti inkubēja 4 grādu temperatūrā primārajā antivielā (HDAC3 klona Y415 antiviela: 1:250; Abcam). Nākamajā dienā priekšmetstikliņus inkubēja 1 stundu istabas temperatūrā ar kazu anti-trušu Alexa 488 (1:1000 atšķaidījums, Invitrogen) tumsā, kam sekoja vai nu 15-minūtes DAPI inkubācija (1: 10 000, Invitrogen; DH). Eksperimentos, kuros tika izmantots sarkans fluorescējošais nissl traips NeuroTrace (1:50 NeuroTrace 530/615; Life Technologies), priekšmetstikliņus inkubēja 50 minūtes istabas temperatūrā, pēc tam divas reizes mazgāja 0,01% Triton-X-100. 5 minūtes un pēc tam divas reizes mazgā PBS 5 minūtes. Priekšmetstikliņi tika pārklāti, izmantojot VectaShield Antifade montāžas līdzekli (Vector Laboratories).

Visi attēli tika iegūti ar Olympus Scanner VS110 ar 20x apohromatisko objektīvu (skaitliskā diafragma 0,75) ar skenera programmatūru VS110. Visas apstrādes grupas tika attēlotas katrā slaidā, un visi attēli uz slaida tika uzņemti ar tādu pašu ekspozīcijas laiku. Imunomarķēšanas intensitāte tika kvantitatīvi noteikta ar ImageJ, ņemot paraugus CA1 šūnu slānī, kas normalizēts uz fona optisko blīvumu.

Kvantitatīvā RT-PCR

Tika veikta kvantitatīvā reāllaika RT-PCR, lai pārbaudītu savvaļas tipa Hdac3mRNS ekspresijas V5 ekspresiju un augšupregulāciju pēc AAV-HDAC3(Y298H) infūzijas (1. eksperiments), kā aprakstīts iepriekš (López et al., 2016; White et al., 2016). 1. eksperimentam 1 mm sitieni DH tika savākti no 500 µm šķēlītēm vīrusa ekspresijas zonā (vai līdzvērtīgā reģionā EV pelēm), ko apstiprināja imunofluorescence. Visi audi līdz apstrādei tika uzglabāti -80 grādu temperatūrā.

RNS tika izolēta, izmantojot RNeasy Minikit (Qiagen), un cDNS tika izveidota, izmantojot Transcriptor First Strand cDNS sintēzes komplektu (Roche Applied Science). Tika izmantoti šādi primeri, kas iegūti no Roche Universal ProbeLibrary: Hdac3right primer, 5'- ttcaacgtgggtgatgactg-3'; Hdac3left primer, 5'- ttagctgtgttgctccttgc-3'; zonde, ctgctccc; Hdac3-v5right primer, 5'-tggagattctcgagggtaagc-3'; Hdac3-v5left primer, 5'- atgccacccgtagatctgg-3'; zonde, ctctcctc. Katra no šo mērķa gēnu zondēm tika konjugēta ar krāsvielu FAM. Gliceraldehīda-3-fosfāta dehidrogenāze (Gapd) tika izmantota kā atsauces gēns visos RT-qPCR testos. Gapd mēs izmantojām šādus primerus: left primer, 5'atggtgaaggtcggtgtga-3'; labais primer, 5-aatctccactttgccactgc-3'; zonde, tggcggtattgg. Gapdzonde tika konjugēta ar LightCycler Yellow 555. Krāsvielas, kas nepārklājas, un dzēsējs uz atsauces gēna ļauj multipleksēt Roche LightCycle 480 II iekārtās (Roche Applied Sciences). Visas vērtības tika normalizētas līdz Gapd izteiksmes līmeņiem. Analīze un statistika tika veikta, izmantojot Roche patentētos algoritmus un REST 2009 programmatūru, kas balstīta uz Pfaffl metodi (Pfaffl 2001; Pfaffl et al., 2002).

OLM un ORM uzdevumi

OLM un jaunu objektu atpazīšanaiatmiņa(ORM), pieradināšanas dati (atsevišķu pieradināšanas sesiju laikā nobrauktais attālums), apmācības un testēšanas video tika savākti, izmantojot ANY-labirinta uzvedības analīzes programmatūru. Apmācība un testēšana OLM un ORM tika veikta, kā aprakstīts iepriekš (López et al., 2016; McQuown et al., 2011; Vogel-Ciernia et al., 2013; Vogel-Ciernia and Wood, 2014). Pirms apmācības peles tika apstrādātas 1–2 minūtes 4 dienas un tika pieradinātas pie eksperimentālā aparāta 5 minūtes OLM kamerā 6 dienas pēc kārtas, ja nebija objektu. Mācību izmēģinājuma laikā peles tika ievietotas eksperimentālajā aparātā ar diviem identiskiem objektiem (OLM: 100 ml vārglāzes, 2,5 cm diametrs, 4 cm augstums; ORM: garšvielu kārbas un stikla sveču turētāji) un ļāva izpētīt šos objektus 3 minūtes. , kas nerada ne īstermiņa, ne ilgtermiņaatmiņa. Mēs jau iepriekš esam parādījuši, ka 3 minūšu apmācības periods ir nepietiekams, lai ģenerētu LTM, kas pārbaudīts 24 stundu laikā (Haettig et al., 2011, 2013; López et al., 2016; McQuown et al., 2011; Stefanko et al., 2009). . Pēc divdesmit četrām stundām dzīvnieku aizturi pārbaudīja 5 minūtes. OLM gadījumā viena pazīstamā objekta kopija tika novietota tajā pašā vietā, kur mācību izmēģinājuma laikā, un viena pazīstamā objekta kopija tika novietota kastes vidū. ORM gadījumā viena pazīstamā objekta kopija un jauns objekts tika novietoti tajā pašā vietā, kur mācību izmēģinājuma laikā. Visi apmācības un testēšanas izmēģinājumi tika ierakstīti video un ar roku vērtējuši personas, kuras nebija akli pret dzīvnieku ārstēšanu. Videoklipi tika analizēti, lai papildus diskriminācijas indeksam (DI) noteiktu objektu pilnīgu izpēti [(laiks, kas pavadīts jauna mērķa izpētei, kas pavadīts pazīstamu objektu izpētē)/(kopējais abu objektu izpētes laiks) × 100 procenti ]. Visas objektu kombinācijas un atrašanās vietas tika izmantotas līdzsvaroti, lai samazinātu iespējamo novirzi, kas attiecināma uz konkrētu vietu vai objektu izvēli.

Kondicionēts vietas izvēles aparāts

Vietas izvēles noteikšana tika veikta, kā aprakstīts iepriekš mūsu pētījumos (Malvaez et al., 2011; Rogge et al., 2013; White et al., 2016). Īsumā, peles tika apstrādātas 1 minūti katru dienu 3 dienas pirms eksperimenta sākuma (1.–3. diena). CPP procedūra visiem eksperimentiem tika veikta, izmantojot objektīvu, līdzsvarotu protokolu. Sākotnējās izvēles katram eksperimentam tika novērtētas, ievietojot dzīvniekus vietas izvēles aparāta centrālajā nodalījumā un ļaujot brīvi piekļūt visiem nodalījumiem 15 minūtes (pirmspārbaude; 4. diena). Treniņu posms sākās vienu dienu pēc priekšpārbaudes. Kondicionēšana tika veikta turpmāko 4 dienu laikā ar aizvērtām giljotīnas durvīm, tādējādi 30 minūtes (5.–8. diena) ievietojot dzīvniekus vienā no diviem CPP aparāta ārējiem nodalījumiem. Tika izmantots objektīvs dizains, lai puse dzīvnieku saņēma kokaīnu pirms ievietošanas rūtainajā nodalījumā un puse saņēma kokaīnu pirms ievietošanas baltajā nodalījumā 1. apmācības dienā (CS plus). Nākamajā dienā ārstēšana un nodalījums tika mainīti katram dzīvniekam (2. apmācības diena), pelēm pirms ievietošanas alternatīvajā nodalījumā (CS−) injicēja fizioloģisko šķīdumu. Injekcijas tika mainītas turpmākajām kondicionēšanas sesijām. Attēlos parādītajiem iegūšanas eksperimentiem. 3–5, dzīvnieki saņēma kopā divus 30-min pārus ar kokaīnu vienā nodalījumā un divus 30-min pārus ar fizioloģisko šķīdumu otrā. Četrdesmit astoņas stundas pēc pēdējās kondicionēšanas sesijas priekšroka (15 minūtes; pēctesta 1; 10. diena) tika novērtēta visiem dzīvniekiem, kā aprakstīts iepriekš, stāvoklī bez zālēm. Attēlos parādītajiem izzušanas eksperimentiem. 6–7, dzīvniekiem tika veikta kondicionēšana, kam sekoja pēcpārbaude 1 48 stundas pēc pēdējās kondicionēšanas sesijas, kā aprakstīts iepriekš. Divas nedēļas pēc vīrusa infūzijas DH vai IL dzīvniekiem katru dienu tika veikti atkārtoti izvēles testi bez zālēm (15 minūtes; pēcpārbaudes 2–5; 25.–28. diena). CPP rezultāts tika aprēķināts kā laiks (-i), kas pavadīts kokaīna pārī (CS plus) mīnus fizioloģiskā šķīduma (CS−) nodalījumos. Laiks, kas pavadīts katrā lielajā ārējā nodalījumā, tika analizēts ar automatizētu programmatūru no MPEG video, izmantojot EthoVision 3.1 programmatūru (Noldus Technology; sk. Malvaez et al., 2011).

Statistiskā analīze

Visām statistiskajām analīzēm tika izmantota Graphpad Prism 7.02 (GraphPad programmatūra).

Pieradināšana tika analizēta, izmantojot divvirzienu ANOVA, lai salīdzinātu kopējo nobraukto attālumu pieradināšanas sesijās. Apmācības un testēšanas dati tika analizēti, izmantojot Stjudenta t-testu, lai salīdzinātu izpēti vai DI starp kontroles un testa dzīvniekiem. Testa dati tika analizēti arī, izmantojot vienpusēju t-testu, salīdzinot DI vērtības ar nulli, lai noteiktu, vai tika novērota būtiska diskriminācija. CPP eksperimenti tika analizēti, izmantojot divvirzienu dispersijas analīzi (ANOVA), kam sekoja Bonferroni sposthoctests ar priekšrocību rādītājiem (PS), pārbaudot kā subjekta mainīgos un grupu/genotipu (tukšs vektors pret Y298H punkta mutantu; Hdac3 plus/plus vs. Hdac3flox/flox). Šis statistiskais tests tika izmantots, lai veiktu īpašus salīdzinājumus, kad tika novērota nozīmīga mijiedarbība un/vai galvenās grupas ietekme. Testa dati tika analizēti arī, izmantojot vienpusēju t-testu, salīdzinot PS vērtības ar nulli, lai noteiktu, vai tika novērota nozīmīga izvēle. Ekstinkcijas eksperimentiem vispirms tika veikti Stjudenta t testi, lai noteiktu, vai dzīvnieki ir devuši nozīmīgu priekšroku 1. pēctestam pirms vīrusu infūzijas. RT-qPCR vērtības tika iegūtas, kā aprakstīts iepriekš. RT-qPCR vērtību atšķirības tika novērtētas ar Stjudenta t-testu. Visām analīzēm nozīmīguma noteikšanai bija nepieciešama vērtība 0,05.