2. daļa|Glikogēna sintāzes kināzes 3b hiperaktivitāte urīna atslāņotās šūnās paredz diabētiskās nieru slimības progresēšanu

Noklikšķiniet šeit, lai skatītu 1. daļu

Lai iegūtu vairāk informācijas, lūdzu, sazinieties ar:emily.li@wecistanche.com

DISKUSIJA

Amerikas Savienotajās Valstīs un citās Rietumu valstīs DKD joprojām ir progresīvās slimības vadošā etioloģijahroniska nieru slimībaun tas uzliek smagu slogu valsts kasei un veselības aprūpes sistēmām, jo ​​vēl nav pieejama galīga ārstēšana.5 Jau sen ir atzīts, ka ne visiem pacientiem ar cukura diabētu sāks attīstīties DN.5 Atkarībā no pētītās kohortas ir aprēķināts, ka DN cieš no 30% līdz 50% diabēta pacientu. Pašreizējā klīniskajā praksē pieņemtie pasākumi, lai identificētu diabēta pacientus, kuriem ir DKD attīstības risks, lielā mērā aprobežojas ar acu pārbaudēm retinopātijas noteikšanai un urīna analīzi albumīnūrijas noteikšanai.5 Tomēr konverģējoši epidemioloģiskie pierādījumi liecina, ka ekstrarenālā mikrovaskulopātija vai albuminūrija būtiski neatbilst tai sekojošajai slimības progresēšanai. DKD.12,13,26,27 Tādēļ ir steidzami jāizstrādā jauns biomarķieris, lai precīzi stratificētu diabēta pacientus, kuriem ir DN risks. Šis pētījums pirmo reizi ziņo, ka GSK3b ir pārmērīgi ekspresēts un hiperaktīvs parenhimālānieresšūnas gan eksperimentālajā, gan klīniskajā DN, kas saistītas arnieru slimības progresēšana. Turklāt GSK3b hiperaktivitāte urīna atslāņotās šūnās, iespējams, spēj paredzēt DN progresēšanu.

Cistanche tubulosa novērš nieru slimību, noklikšķiniet šeit, lai iegūtu paraugu

GSK3b, ļoti konservēta, redoksjutīga serīna/treonīna-proteīna kināze, ir centrāli iesaistīta insulīna signalizācijā, kā arī vairākos citos šūnu signālu ceļos, kas ir būtiski patofizioloģiskajos procesos, kas saistīti arnieresievainojums, remonts un reģenerācija. Pret insulīnu jutīgos audos, piemēram, aknās un skeleta muskuļos, GSK3b ir aktīvs pamata apstākļos un nomāc glikogēna sintāzes aktivitāti.19,28 Insulīns ātri inaktivē GSK3b, izmantojot inhibējošu fosforilāciju serīnā 9, kā rezultātā notiek glikogēna biosintēze. Arvien vairāk pierādījumu liecina, ka GSK3b disregulācija ir saistīta ar 2. tipa cukura diabētu.19, 29–31 Patiešām, ir dati, kas liecina par GSK3b pārmērīgu ekspresiju un hiperaktivitāti diabēta pacientu muskuļos31–33 un aptaukošanās diabēta peļu taukaudos.34 Turklāt , GSK3b transgēna pārmērīga ekspresija peļu skeleta muskuļos izraisa glikozes tolerances, insulīna rezistences un hiperinsulinēmijas traucējumus.29,35 Savukārt pelēm, kurām skeleta muskuļos trūkst GSK3b, bija uzlabota glikozes tolerance.36 Konsekventi GSK3 inhibitori, piemēram, litija atdarina insulīna darbību šūnu līnijās un audos.37 Turklāt aptaukošanās diabēta pelēm GSK3 inhibitori uzlaboja jutību pret insulīnu un glikozes homeostāzi.nierestradicionāli nav uzskatīts par insulīna darbības mērķa orgānu. Tomēr pārliecinoši pierādījumi nesen liecināja, ka insulīna signalizācijanieresšūnām, jo ​​īpaši podocītos, ir galvenā loma glomerulārās unniereshomeostāze.39–41 Bojāta insulīna signalizācija podocītos insulīna deficīta vai rezistences dēļ, iespējams, ir galvenais iniciators daudziem patoloģiskiem bojājumiem, kas novēroti DN. Turklāt klīniskie pētījumi ir parādījuši, ka insulīna rezistence korelē ar albuminūrijas rašanos un smagumu pat normotensīviem pacientiem, kuriem nav cukura diabēta, kas liecina, ka insulīna rezistence pati par sevi var izraisīt albuminūriju.42 Tāpat arī pelēm ar podocītu specifisku insulīna rezistenci, kas panākta ar nosacīts insulīna receptoru nojaukums glomerulārajos podocītos, attīstījusies albumīnūrija un glomerulāri bojājumi, kas atkārto DN, neskatoties uz to, ka nav hiperglikēmijas vai diabēta.41 Un otrādi, dzīvniekiem ar cukura diabētu insulīna sensibilizatori spēj palēnināt DN progresēšanu neatkarīgi no glikēmijas kontroles.43 Šie atklājumi liecina, ka insulīna signalizācija regulē podocītu darbību neatkarīgi no glikozes līmeņa asinīs. Tomēr kā galvenā insulīna signalizācijas ceļa pārveidotāja GSK3b loma DN patoģenēzē un progresēšanā ir ļoti maz pētīta.

Iekšnieres, GSK3b galvenokārt tiek ekspresēts podocītos un mazākā mērā mezangiālajās un endotēlija šūnās glomerulos 20, 21, un to plaši ekspresē nieru kanāliņu šūnas. Ir dati no mūsu un citām grupām, kas liecina, ka GSK3b mediē podocītu autonomos bojājumus, integrējot vairākus podocītu topātiskos signalizācijas ceļus.17,20,44,45 GSK3b nekonsekvence, ģenētiska vai farmakoloģiska blokāde var aizsargāt pret podocītu bojājumiem un vājināt proteīnūriju dzīvnieku modeļos dažādas nediabētiskas glomerulopātijas.21 Turklāt progresīvāhroniskanieresslimība, tika konstatēts, ka GSK3b ir nieru kanāliņu un intersticiālu bojājumu modulators. Tomēr tas, vai un kā GSK3b ir iesaistīts DN, ir bijis neskaidrs un ļoti pretrunīgs, lai gan šis pētījums parādīja, ka uzlabota GSK3b aktivācijanieresun urīna eksfoliācijas šūnās var būt saistītas ar DKD attīstību vai progresēšanu. Piemēram, žurkām ar streptozotocīna izraisītu diabētu Lin et al.46 atklāja, ka GSK3b inhibīcija ar adenozīna trifosfāta konkurējošo inhibitoru (20 Z, 30 E)-6- Broma indirubīna-30 -oksīmā ( BIO) novājināja proteīnūriju un uzlaboja DN glomerulāros bojājumus, ja nebija hiperglikēmijas korekcijas, kas liecina, ka GSK3b ir kaitīga loma DN. Arī žurkām ar streptozotocīna izraisītu diabētu Paeng et al.22 veica līdzīgus konstatējumus, izmantojot BIO, un secināja, ka pastiprināta GSK3b aktivitāte podocītos diabēta apstākļos ir saistīta ar podocītu apoptozi un DN zudumu. Tas atbilst citam in vitro pētījumam, kurā tika konstatēts, ka GSK3b veicina podocītu diferenciāciju un ievainojumus pēc pakļaušanas barotnei ar augstu glikozes līmeni.47 Gluži pretēji, Mariappan et al.48 apgalvoja, ka GSK3b aktivizēšana tā vietā uzlabo diabēta izraisīto stāvokli.nieresievainojums. Savā pētījumā streptozotocīna izraisītas diabēta peles tika ārstētas ar nātrija nitroprussīdu, slāpekļa oksīda donoru, kas spēj aktivizēt GSK3b. Viņi atklāja, ka albumīnūrija, nieru hipertrofija un ārpusšūnu matricas uzkrāšanās glomerulos tika uzlaboti, ja nav uzlabojusies hipertensija vai hiperglikēmija. Tomēr šie atklājumi ir krasā pretrunā ar datiem, kas iegūti no gēnu mērķa pelēm ar konstitutīvi aktīvu GSK3, kas attīstīja spontānu albumīnūriju un podocītu bojājumu.49 Lai saskaņotu pretrunīgos konstatējumus, jāievēro piesardzība, interpretējot datus, kas iegūti, izmantojot ķīmiskos inhibitorus vai aktivatorus. no GSK3b. Lai gan ir vairākkārt apstiprināts, ka BIO ir ļoti selektīvs GSK3b mazmolekulārs inhibitors, nātrija nitroprussīds nav specifisks GSK3b aktivators, bet zināms, ka tam ir spēcīgs hemodinamisks efekts50, kas, iespējams, var sajaukt tā albumīnūriju mazinošo un renoprotektīvo darbību. diabēta pelēm. Kopumā, neskatoties uz dažiem pretrunīgiem datiem, dominējošie pierādījumi liecina, ka GSK3b, iespējams, ir saistīts arnieresievainojumsun proteīnūrija DN. Jāpiemin daži šī pētījuma ierobežojumi. Pirmkārt, preklīniskie dati aprobežojās tikai ar DB / DB peles modeļiem. Lai noteiktu GSK3b lomas vispārināmībucukura diabēta nieru bojājums, ir nepieciešams apstiprināt konstatējumus citos DN modeļos, tostarp 1. tipa DN modeļos. Otrkārt, klīniskie novērojumi šeit tika iegūti no retrospektīvām diabēta pacientu grupām ar ierobežotu izlases lielumu un salīdzinoši īsu novērošanas laiku. Jāatzīst, ka ir nepieciešami liela mēroga, perspektīvi, randomizēti, daudzcentru pētījumi, lai pārbaudītu mūsu novērojumus un apstiprinātu GSK3b spēku urīna eksfoliācijas šūnās, prognozējot DKD iznākumu.

GSK3b, ļoti konservēta, redoksjutīga serīna/treonīna-proteīna kināze, ir centrāli iesaistīta insulīna signalizācijā, kā arī vairākos citos šūnu signālu ceļos, kas ir būtiski patofizioloģiskajos procesos, kas saistīti arnieresievainojums, remonts un reģenerācija. Pret insulīnu jutīgos audos, piemēram, aknās un skeleta muskuļos, GSK3b ir aktīvs pamata apstākļos un nomāc glikogēna sintāzes aktivitāti.19,28 Insulīns ātri inaktivē GSK3b, izmantojot inhibējošu fosforilāciju serīnā 9, kā rezultātā notiek glikogēna biosintēze. Arvien vairāk pierādījumu liecina, ka GSK3b disregulācija ir saistīta ar 2. tipa cukura diabētu.19, 29–31 Patiešām, ir dati, kas liecina par GSK3b pārmērīgu ekspresiju un hiperaktivitāti diabēta pacientu muskuļos31–33 un aptaukošanās diabēta peļu taukaudos.34 Turklāt , GSK3b transgēna pārmērīga ekspresija peļu skeleta muskuļos izraisa glikozes tolerances, insulīna rezistences un hiperinsulinēmijas traucējumus.29,35 Savukārt pelēm, kurām skeleta muskuļos trūkst GSK3b, bija uzlabota glikozes tolerance.36 Konsekventi GSK3 inhibitori, piemēram, litija imitēt insulīnu

darbība šūnu līnijās un audos.37 Turklāt aptaukošanās diabēta pelēm GSK3 inhibitori uzlaboja jutību pret insulīnu un glikozes homeostāzi.38 Tradicionāli nieres nav uzskatītas par insulīna darbības mērķa orgānu. Tomēr nesen pārliecinoši pierādījumi liecina, ka insulīna signalizācijai nieru šūnās, jo īpaši podocītos, ir galvenā loma glomerulārās un nieru homeostāzes uzturēšanā.39–41 Bojāta insulīna signalizācija podocītos insulīna deficīta vai rezistences dēļ, iespējams, ir galvenais ierosinātājs. daudziem patoloģiskiem bojājumiem, kas novēroti DN. Turklāt klīniskie pētījumi ir parādījuši, ka insulīna rezistence korelē ar albuminūrijas rašanos un smagumu pat normotensīviem pacientiem, kuriem nav cukura diabēta, kas liecina, ka insulīna rezistence pati par sevi var izraisīt albuminūriju.42 Tāpat arī pelēm ar podocītu specifisku insulīna rezistenci, kas panākta ar nosacīts insulīna receptoru nojaukums glomerulārajos podocītos, attīstījusies albumīnūrija un glomerulāri bojājumi, kas atkārto DN, neskatoties uz to, ka nav hiperglikēmijas vai diabēta.41 Un otrādi, dzīvniekiem ar cukura diabētu insulīna sensibilizatori spēj palēnināt DN progresēšanu neatkarīgi no glikēmijas kontroles.43 Šie atklājumi liecina, ka insulīna signalizācija regulē podocītu darbību neatkarīgi no glikozes līmeņa asinīs. Tomēr kā galvenā insulīna signalizācijas ceļa pārveidotāja GSK3b loma DN patoģenēzē un progresēšanā ir ļoti maz pētīta.

Nierēs GSK3b galvenokārt tiek ekspresēts podocītos un mazākā mērā mezangiālajās un endotēlija šūnās glomerulos 20, 21, un to plaši ekspresē nieru kanāliņu šūnas. Ir dati no mūsu un citām grupām, kas liecina, ka GSK3b mediē podocītu autonomos bojājumus, integrējot vairākus podocītu patiskos signālu ceļus.17,20,44,45 GSK3b nekonsekvence, ģenētiska vai farmakoloģiska blokāde var aizsargāt pret podocītu bojājumiem un vājināt proteīnūriju dzīvnieku modeļos dažādas nediabētiskas glomerulopātijas.21 Turklāt progresējošas hroniskasnieresslimība, tika konstatēts, ka GSK3b ir nieru kanāliņu un intersticiālu bojājumu modulators. Tomēr tas, vai un kā GSK3b ir iesaistīts DN, ir bijis neskaidrs un ļoti pretrunīgs, lai gan šis pētījums parādīja, ka pastiprināta GSK3b aktivācija nierēs un urīna atslāņotās šūnās var būt saistīta ar DKD attīstību vai progresēšanu. Piemēram, žurkām ar streptozotocīna izraisītu diabētu Lin et al.46 atklāja, ka GSK3b inhibīcija ar adenozīna trifosfāta konkurējošo inhibitoru (20 Z, 30 E)-6- Broma indirubīna-30 -oksīmā ( BIO) novājināja proteīnūriju un uzlaboja DN glomerulāros bojājumus, ja nebija hiperglikēmijas korekcijas, kas liecina, ka GSK3b ir kaitīga loma DN. Arī žurkām ar streptozotocīna izraisītu diabētu Paeng et al.22 veica līdzīgus konstatējumus, izmantojot BIO, un secināja, ka pastiprināta GSK3b aktivitāte podocītos diabēta apstākļos ir saistīta ar podocītu apoptozi un DN zudumu. Tas atbilst citam in vitro pētījumam, kurā tika konstatēts, ka GSK3b veicina podocītu diferenciāciju un ievainojumus pēc pakļaušanas barotnei ar augstu glikozes līmeni.47 Gluži pretēji, Mariappan et al.48 apgalvoja, ka GSK3b aktivizēšana tā vietā uzlabo diabēta izraisīto stāvokli.nieresievainojums. Savā pētījumā streptozotocīna izraisītas diabēta peles tika ārstētas ar nātrija nitroprussīdu, slāpekļa oksīda donoru, kas spēj aktivizēt GSK3b. Viņi atklāja, ka albumīnūrija, nieru hipertrofija un ārpusšūnu matricas uzkrāšanās glomerulos tika uzlaboti, ja nav uzlabojusies hipertensija vai hiperglikēmija. Tomēr šie atklājumi ir krasā pretrunā ar datiem, kas iegūti no gēnu mērķa pelēm ar konstitutīvi aktīvu GSK3, kas attīstīja spontānu albumīnūriju un podocītu bojājumu.49 Lai saskaņotu pretrunīgos konstatējumus, jāievēro piesardzība, interpretējot datus, kas iegūti, izmantojot ķīmiskos inhibitorus vai aktivatorus. no GSK3b. Lai gan ir vairākkārt apstiprināts, ka BIO ir ļoti selektīvs GSK3b mazmolekulārs inhibitors, nātrija nitroprussīds nav specifisks GSK3b aktivators, bet zināms, ka tam ir spēcīgs hemodinamisks efekts50, kas, iespējams, var sajaukt tā albumīnūriju mazinošo un renoprotektīvo darbību. diabēta pelēm. Kopumā, neskatoties uz dažiem pretrunīgiem datiem, dominējošie pierādījumi liecina, ka GSK3b, iespējams, ir saistīts arnieresievainojumsun proteīnūrija DN. Pāris ierobežojumi

jāpiemin pašreizējais pētījums. Pirmkārt, preklīniskie dati aprobežojās tikai ar dB / dB peļu modeļiem. Lai noteiktu GSK3b lomas vispārināmībucukura diabēta nieru bojājums, ir nepieciešams apstiprināt konstatējumus citos DN modeļos, tostarp 1. tipa DN modeļos. Otrkārt, klīniskie novērojumi šeit tika iegūti no retrospektīvām diabēta pacientu grupām ar ierobežotu izlases lielumu un salīdzinoši īsu novērošanas laiku. Jāatzīst, ka ir nepieciešami liela mēroga, perspektīvi, randomizēti, daudzcentru pētījumi, lai pārbaudītu mūsu novērojumus un apstiprinātu GSK3b spēku urīna eksfoliācijas šūnās, prognozējot DKD iznākumu.

Rezumējot, mūsu pētījumi parādīja, ka GSK3b nieru ekspresija un aktivitāte tiek pastiprināta eksperimentālajā un klīniskajā DN. GSK3b aktivitāte urīna lobītajās šūnās var kalpot kā jauns biomarķieris DN progresēšanas prognozēšanai. Mūsu dati var pavērt ceļu liela mēroga, padziļinātai izpētei par vērtību, ko GSK3b urīna atslāņotās šūnās var kalpot par DN prognostisku biomarķieri.

METODES

Pētījumi ar dzīvniekiem

Pētījumus ar dzīvniekiem apstiprināja Institucionālā dzīvnieku aprūpe un komiteja, un tie atbilst ASV Lauksaimniecības departamenta noteikumiem un Nacionālo veselības institūtu rokasgrāmatai par cilvēku aprūpi un laboratorijas dzīvnieku izmantošanu. DB/DB peļu tēviņi un kontroles db/m metiena biedri 6 nedēļu vecumā tika iegādāti no Naņdzjinas Universitātes Modeļu dzīvnieku pētniecības centra (Nandzjinga, Ķīna) un tika izmitināti Džendžou Universitātes Centrālajā dzīvnieku kompleksā. Visas peles tika barotas ad libitum, un norādītajā vecumā tika nogalinātas 8 līdz 10 peles. Urīna un asins paraugi tika ņemti norādītajos laika punktos. Pēc nogalināšanas nieres tika novāktas turpmākai pārbaudei. Albumīna līmenis urīnā tika mērīts, izmantojot peles albumīna enzīmu saistītu imūnsorbcijas testa kvantitatīvās noteikšanas komplektu (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Urīna kreatinīna līmenis tika noteikts, izmantojot kreatinīna noteikšanas komplektu (BioAssay Systems, Hayward, CA).

Šūnu kultūra

Nosacīti iemūžināti peļu podocīti starp 21. un 25. eju tika kultivēti Roswell Park Memorial Institute 1640 barotnē, kas papildināta ar 10 procentiem liellopu augļa seruma pieļaujamos apstākļos, kā aprakstīts iepriekš.22 Podocītu subkultūras tika pakļautas nepieļaujamiem apstākļiem, lai izraisītu diferenciāciju, un tika turētas 14 dienas. pēc tam tika pakļauta normālai videi/kultūras barotnei, kas satur 5 mM glikozes, diabētiskajai videi, kas sastāv no glikozes (25 mM) un transformējošā augšanas faktora b1 (2 ng/ml), vai augstas osmolalitātes kontroles barotnei, kas satur 20 mM mannītu 48 minūtes. stundas. Peļu proksimālās kanāliņu epitēlija šūnas un peles glomerulārās mezangiālās šūnas tika uzturētas Dulbecco modificētajā Eagle barotnē/F12, kas papildināts ar 5 procentiem liellopu augļa seruma. Šūnas 24 stundas tika izklātas ar 70 procentu saplūšanu barotnē, kas satur 5 procentus liellopu augļa seruma, un pēc tam vēl 24 stundas tika pakļautas seruma badam, kam sekoja iedarbība uz normālu vidi/kultūras barotni, kas saturēja 5 mM glikozes, diabētiskā vidē, kas sastāvēja no augsta glikozi (25 mM) un transformējošo augšanas faktoru b1 (2 ng/ml), vai augstas osmolalitātes kontroles barotni, kas satur 5 mM glikozes un 20 mM mannīta 48 stundas. Šūnu dzīvotspēja tika novērtēta ar tripāna zilo izslēgšanu. Norādītajos laika punktos šūnas tika fiksētas vai šūnu lizāti tika savākti turpmākai izmeklēšanai.

Pārejoša vektoru transfekcija

Vektorus, kas kodē tukšu vektoru vai GSK3b hemaglutinīna (HA) iezīmēto konstitutīvi aktīvo (S9A) mutantu (S9A-GSK3b-HA/pcDNA3), nodrošināja Dr. Gail VW Johnson (Birmingema, AL), un tie tika transfekēti uz kultivētiem podocītiem, mezangiālās šūnas un cauruļveida epitēlija šūnas, izmantojot Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA), kā aprakstīts iepriekš.44 Transfekcijas efektivitāte tika pārbaudīta ar imūnfluorescences krāsošanu vai imūnblotēšanu HA pēc 12 stundām. Pēc tam šūnas tika savāktas un sagatavotas Western blot analīzei vai citiem testiem.

RNAi

3 peļu kopums GSK3b specifiskiem maziem, traucējošiem RNS dupleksiem — 50-CUUGUCCUGUAGAACUUUCtt-30, 50-AUGAUCCAUUUCCAAUCACtt-30 un 50-AUACCGCAGUCGGACUAUGtt-30 — tika izstrādāti un sintezēti saskaņā ar peles GSK3b gēna pilnīgu kodēšanas secību (GenBank pievienošanās nr. BC060743.1). Turklāt kā RNSi kontrole tika izmantota sajaukta maza, traucējoša RNS secība (50-GCGAGUAGCGCUAGGAAGUtt-30) bez sekvences līdzības ar zināmām gēnu sekvencēm no pelēm, žurkām vai cilvēkiem. Lipofektamīna (Invitrogen, Carlsbad, CA) mediētās gēnu klusēšanas efektivitāte tika novērtēta ar GSK3b imūnblota analīzi. Apmierinoša GSK3b proteīna ekspresijas nomākšana tika novērota kultivētos podocītos, mezangiālajās šūnās un cauruļveida epitēlija šūnās 24 stundas pēc RNSi. Pēc tam šūnas tika pakļautas normālai videi/kultūras barotnei, diabētiskajai videi vai augstas osmolalitātes kontroles barotnei 48 stundas, kā norādīts iepriekš, pirms šūnas tika apstrādātas turpmākām pārbaudēm.

Klīniskie pētījumi

Šī pētījuma klīniskā daļa atbilda 1975. gada Helsinku deklarācijas ētikas vadlīnijām, un to apstiprināja Džendžou Universitātes Pirmās saistītās slimnīcas Institucionālā pārskata padome. Cilvēku pētījumu dalībnieki netika īpaši pieņemti darbā šim pētījumam. Visi klīniskie dati tika savākti, retrospektīvi pārskatot diagrammas un pārbaudot arhivētas audu daļas vai urīna paraugus. Pārmērīgi vai izmesti nieru biopsijas paraugi, kā arī frakcionēti urīna paraugi ir regulāri reģistrēti Džendžou universitātes Pirmās saistītās slimnīcas Nefroloģijas institūtā. Pārbaudei pēc nejaušības principa tika izvēlēti arhivēti neidentificēti formalīnā fiksēti parafīnā iestrādātie nieru biopsijas audi no pacientiem dažādās DN stadijās. Papildu nieru paraugi bez histomorfoloģiskiem bojājumiem tika iegūti no nierēm, kas tika izmestas transplantācijai asinsvadu anomāliju dēļ, vai no pirmsimplantācijas biopsijas audiem un kalpoja kā normālas kontroles. Retrospektīvā kohortas pētījumā kopumā 127 pacienti ar 2. tipa cukura diabētu, kuriem kopš 2010. gada tika novēroti frakcionēta urīna paraugi, tika retrospektīvi pārbaudīti, lai iekļautu šajā pētījumā. Pētītie pacienti bija vecumā no 29 līdz 80 gadiem, un viņiem tika diagnosticēts 2. tipa cukura diabēts saskaņā ar Amerikas Diabēta asociācijas kritērijiem. Izslēgšanas kritēriji ietvēra pārraudzības zaudēšanu, nepietiekamu informāciju,nieresdisfunkcija, or overt proteinuria at baseline, or other superimposed kidney diseases such as acute kidney injury or glomerulopathies. Finally, 60 patients have enrolled in this study for further assessment. All patients had been followed up for >5 gadi. Regulāras novērošanas laikā tika dokumentēti demogrāfiskie dati, kā arī klīniskie parametri, tostarp dzimums, vecums, blakusslimības, medikamenti, diabēta ilgums, asinsspiediens, glikēmiskais līmenis, kreatinīna līmenis serumā, urīna analīzes dati, AAE un eGFR. Klīniskais iznākums pēc 5 gadu novērošanas bija nieru darbības traucējumu progresēšanas esamība vai neesamība, kas tika definēta kā eGFR samazinājums par USD 25 procentiem vai albumīnūrijas progresēšana, par ko liecina albuminūrijas smaguma pakāpes palielināšanās dažādās klīniskās stadijās. DN, tas ir, normoalbuminūrija, mikroalbuminūrija, makroalbuminūrija vai atklāta proteīnūrija. Visi pacienti sniedza rakstisku informētu piekrišanu.

Nieru morfoloģijas novērtējums un imūnhistoķīmiskā analīze

Parafīnā iestrādātie, formalīnā fiksētie peles nieru audu bloki tika sagriezti 3- mm sekcijās. Vispārējai histoloģijai sekcijas tika apstrādātas periodiskai skābes – Šifa krāsošanai. GSK3b un p-GSK3b imūnhistoķīmiskā krāsošana tika veikta, izmantojot VECTASTAIN ABC komplektu (Vector Laboratories, Burlingame, CA), kā aprakstīts iepriekš.20 Kā negatīvu kontroli primārā antiviela tika aizstāta ar tās pašas sugas neimunālo serumu; krāsojums nenotika. Visu sekciju morfoloģiskās pazīmes aklā veidā novērtēja viens novērotājs ar nieru patologa palīdzību.

Imunofluorescējoša krāsošana

Kultivētās šūnas vai saldētas kriostata sekcijas tika fiksētas un iekrāsotas ar primārajām antivielām, un pēc tam tika uzklātas ar Alexa Fluor konjugētas sekundārās antivielas (Invitrogen). Kā negatīva kontrole primārās antivielas tika aizstātas ar pirmsimūno IgG no tās pašas sugas; krāsojums nenotika. Visbeidzot, sekcijas tika iekrāsotas ar 40,6-diamidino-2-fenilindolu vai propīdija jodīdu un piestiprinātas ar VECTASHIELD montāžas līdzekli (Vector Laboratories). FL fluorescences mikroskopijai visas sekcijas tika analizētas vienlaikus, lai izslēgtu artefaktus, kas radušies fluorohroma mainīgas sabrukšanas dēļ. Sekcijas tika pārbaudītas, izmantojot Olympus FL fluorescences mikroskopu, kas aprīkots ar Spot II digitālo kameru (Olympus, Tokija, Japāna). Divkrāsu krāsošanai attēli tika iegūti secīgi, lai izvairītos no krāsas traucējumiem. ImageJ programmatūra (Nacionālie veselības institūti, Bethesda, MD) tika izmantota attēlu pēcapstrādei, piemēram, mērogošanas, apvienošanas un kolokalizācijas analīzei.

Datorizēta morfometrija

Imūnhistoķīmiskās krāsošanas attēli tika uzņemti un digitalizēti, izmantojot datorizētu attēlu analīzes sistēmu, kas sastāv no augstas izšķirtspējas ar lādiņu savienotas ierīces digitālās kameras, kas pievienota mikroskopam (Olympus BX41, Olympus) un datoram. Attēli tika parādīti ar pikseļu izšķirtspēju 1024 768 pikseļi (telpiskā izšķirtspēja, 0,24 mm/pikseļi). Cilvēka nieru audu imūnhistoķīmiskās krāsošanas attēliem ImageJ programmatūra tika izmantota attēlu segmentēšanai, sliekšņa noteikšanai un signāla intensitātes mērījumiem. Manuālas korekcijas tika veiktas pēc vajadzības. Kopumā morfometriskajai analīzei tika ņemti paraugi no 10 glomeruliem vai 10 nejaušiem tubulointersticiāliem laukiem, un galīgie dati tika izteikti kā integrētā pikseļu blīvuma vērtība attiecībā pret kontroles grupu.

Rietumu imūnblota analīze

Kultivētās šūnas tika lizētas;nieresaudusvai izolēti nieru glomeruli tika homogenizēti radioimūnprecipitācijas testa buferī, kas papildināts ar proteāzes inhibitoriem, un paraugi tika apstrādāti imūnblota analīzei. Lai veiktu imūnblota analīzi ierobežotam eksfoliēto šūnu skaitam urīnā, Western blot protokols tika modificēts, kā aprakstīts iepriekš, izmantojot augstas veiktspējas NuPAGE Bis-Tris Gels (Invitrogen) un augstas kvalitātes pārneses membrānas.25 Uzlabota imūnblotēšana varētu būt noteikt vidēji izteiktus proteīnus tikai 1000 šūnās. Antivielas pret GSK3b, fibronektīnu, kolagēnu IV, aktīnu un gliceraldehīda -3-fosfāta dehidrogenāzi (GAPDH) tika iegādātas no Santa Cruz Biotechnology (Santakrusa, Kalifornija); zāles pret sinaptopodīnu tika iegādātas no PROGEN Biotechnik GmbH (Heidelberga, Vācija); un pret ZO-1 un p-GSK3b vērstie tika iegūti no Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

Statistiskā analīze

All in vitro studies were repeated 3 to 6 times. For immunoblot analysis, bands were scanned and the integrated pixel density was determined using a densitometer and the ImageJ analysis program, version 1.48 (National Institutes of Health). Data were expressed as mean -SD or median (interquartile range). All included patients had baseline data. Patients with missing data or lost to follow-up were excluded from this study. Continuous variables were analyzed as appropriate by using the t-test, Mann-Whitney U test, or 1-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Student-NewmanKeuls test if there were 3 comparisons or by the Scheffé test if there were >3 salīdzinājumi. Kategoriskie dati tika salīdzināti starp grupām, izmantojot hī kvadrāta testu. Lineārās regresijas analīze tika izmantota, lai pārbaudītu iespējamās attiecības starp 2 parametriem. Tika veiktas viendimensiju Koksa proporcionālās bīstamības regresijas analīzes, lai novērtētu saistību starp attiecīgajiem mainīgajiem lielumiem un nieru darbības traucējumu progresēšanas risku, kam sekoja daudzfaktoru analīze attiecībā uz iespējamiem sajaukšanas faktoriem. Tika veikta ROC līknes analīze un tika izmērīti laukumi zem ROC līknēm, lai analizētu noteiktu mainīgo lielumu ietekmi, prognozējot nieru darbības traucējumu progresēšanu diabēta pacientiem. Nenormāli sadalīti mainīgie, piemēram, AAE, tika pārveidoti ar logaritmu, lai panāktu normālu Koksa proporcijas apdraudējumu regresijas analīzes ROC līknes analīzēm. Visas statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot PSS versiju 22 (IBM Corporation, Armonk, NY). P vērtības<0.05 in2-tailed="" tests="" were="" considered="" statistically="" significant="" in="" all="">

ATKLĀŠANA

Visi autori nav paziņojuši par konkurējošām interesēm.

PATEICĪBA

Daļa no šī pētījuma tika prezentēta kā mutiska prezentācija KidneyWeek 2016: American Society of Nephrology Annual Meeting, 2016. gada 15.–20. novembrī Čikāgā, IL. RG daļēji atbalstīja Veselības fonds. XL tika atbalstīta ar pētniecības stipendiju, lai saņemtu neklātienes apmācību. ZL atbalstīja Ķīnas Nacionālā dabaszinātņu fonda dotācijas U1604284, 81770672 un 81873612. Finansētājiem nebija nekādas lomas šī pētījuma izstrādē un veikšanā, datu apkopošanā un interpretācijā vai manuskripta sagatavošanā un apstiprināšanā.

AUTORU IEGULDĪJUMI

RG izstrādāja konceptuālās idejas. XL, ZL un RG piedalījās pētījuma izstrādē. XL, PW, BC, YG, AYG un BF veica šūnu kultūras eksperimentus. XL un ZL veica eksperimentus ar dzīvniekiem un apkopoja datus no diabēta pacientiem. XL, LJW, DKM, LDD, ZL, un piedalījās diskusijā un rezultātu interpretācijā. uzņēmās vadību manuskripta rakstīšanā. XL, BC un BF piedalījās manuskriptu rediģēšanā. Visi autori vienojās, ka visa šī darba koncepcija un īpašumtiesības pieder RG. Visi autori apstiprināja galīgo manuskriptu.

PAPILDU MATERIĀLS

Papildu metodes.

S1 tabula. Kontroles subjektu un pacientu ar diabētisko nefropātiju raksturojums, stratificēts atbilstoši diabētiskās nefropātijas histoloģiskajām klasēm. S2 tabula. Sākotnējie demogrāfiskie, klīniskie un laboratoriskie dati par agrīnās stadijas diabēta pacientu retrospektīvo kohortu bez DKD pazīmēm. S3 tabula. Demogrāfiskie, klīniskie un laboratoriskie dati par 2. tipa diabēta agrīnās stadijas pacientiem, kas stratificēti atbilstoši nieru iznākumam pēc 5 gadu novērošanas. S1 attēls. GSK3b pastiprinātā nieru darbība paredz slimības attīstību un smagumudiabētiķisnieresslimībadb/db pelēm. Peļu tēviņi db/db un db/m tika novēroti vecumā no 4 līdz 13 nedēļām. (A) Asins paraugi tika ņemti no nebadētām pelēm 4 un 7 nedēļu vecumā, un tika pārbaudīts glikozes līmenis plazmā. *P < 0.001="" pret="" db/m="" pelēm="" 7="" nedēļu="" vecumā.="" n="" ¼="" 15–18.="" (b)="" urīna="" paraugi="" tika="" ņemti="" 4,="" 7,="" 10="" un="" 13="" nedēļu="" vecumā="" un="" tika="" pakļauti="" urīna="" albumīna="" un="" urīna="" kreatinīna="" noteikšanai,="" lai="" noteiktu="" urīna="" albumīna="" un="" kreatinīna="" attiecību="" (uacr).="" *p="">< 0,001="" pret="" db/m="" pelēm="" 10="" nedēļu="" vecumā="" (n="" ¼="" 15–18);="" #p="">< 0,001="" pret="" db/m="" pelēm="" 13="" nedēļu="" vecumā.="" n="" ¼="" 15–18.="" (c)="" visas="" peles="" saņēma="" atvērtu="" nieru="" biopsiju="" 7="" nedēļu="" vecumā,="" un="" biopsijas="" paraugi="" tika="" apstrādāti="" imūnblota="" analīzei="" p-gsk3b,="" gsk3b="" un="" gapdh.="" (d)="" imunobloti="" tika="" pakļauti="" densitometriskai="" analīzei.="" gsk3b="" un="" p-gsk3b="" relatīvais="" daudzums="" tika="" noteikts="" kā="" attiecīgās="" molekulas="" gapdh="" densitometriskās="" attiecības="" kā="" reizes="" izmaiņas,="" salīdzinot="" ar="" kontroles="" db="" m="" pelēm.="" gsk3b="" relatīvā="" aktivitāte="" tika="" aprēķināta="" kā="" p="" gsk3b="" attiecība="" pret="" gsk3b="" kā="" kontroles="" db/m="" peļu="" krokas.="" (e)="" lineārās="" regresijas="" analīze="" parādīja="" statistiski="" nozīmīgu="" pozitīvu="" korelāciju="" starp="" nieru="" gsk3b="" aktivitāti="" 7="" nedēļu="" vecumā="" db/db="" pelēm="" un="" albuminūrijas="" attīstību="" un="" smagumu,="" kas="" ir="">diabētiķisnieresslimība13 nedēļu vecumā. R ¼ 0.699; P ¼ 0.{16}}{{20}}1. (F) Uztvērēja darbības raksturlīknes analīze parādīja, ka nieru GSK3b aktivitāte agrīnā diabēta stadijā (7 nedēļu vecumā) nodrošina izcilu precizitāti un jaudu, prognozējot albuminūrijas un DKD attīstību 13 nedēļu vecumā db / db pelēm. S2 attēls. Insulīna rezistence un augsts apkārtējās vides glikozes līmenis sinerģiski aktivizē GSK3b nieru šūnās. (A) kultivēti peles podocīti, (B) urīna glomerulārās mezangiālās šūnas (MMC) un (C) nieru kanāliņu epitēlija šūnas (TEC) tika transficētas ar kodētiem siRNS oligonukleotīdiem (siCon) vai siRNS oligonukleotīdiem (siIRb), kas specifiski b izoformai. insulīna receptoru (IRB), lai modelētu insulīna rezistences stāvokli in vitro. Pēc tam šūnas 48 stundas tika pakļautas normālai glikozi saturošai normālai videi (NG) vai augstu glikozi saturošai diabētiskajai videi (HG). Šūnu lizāti tika savākti un pakļauti IRB, p-GSK3b, GSK3b un GAPDH imūnblota analīzei, kam sekoja blotu densitometriskā analīze. *P < 0,01="" pret="" irb="" ekspresiju="" ar="" sicon="" apstrādātās="" šūnās,="" kas="" pakļautas="" tai="" pašai="" videi="" (n="" ¼="" 3),="" #p="">< 0,05="" pret="" to="" pašu="" proteīna="" ekspresiju="" siirb="" þ="" ng="" vai="" sicon="" þ="" hg="" grupā="" (n="" ¼="" 3),="" &="" p="">< 0,05="" pret="" to="" pašu="" proteīna="" ekspresiju="" otrajā="" þ="" hg="" vai="" siirb="" þ="" ng="" grupā="" (n="" ¼="" 3).="" s3="" attēls.="" gsk3b="" mrns="" ekspresijas="" līmeņi="" cilvēka="" nieru="" paraugos,="" kas="" iegūti="" no="" veseliem="" donoriem="" un="" pacientiem="" ar="" diabētisku="" nefropātiju.="" dati="" tika="" iegūti="" no="" www.nephroseq.org,="" pamatojoties="" uz="" ju="" ckd="" glom="" datu="" kopu51,="" un="" izteikti="" kā="" log2="" vidējā="" intensitāte.="" s4="" attēls.="" paaugstināta="" gsk3b="" aktivitāte="" urīna="" atslāņotās="" šūnās,="" kas="" savāktas="" no="" agrīnas="" stadijas="" diabēta="" pacientiem,="" paredz="" diabētiskās="" nieru="" slimības="" attīstību.="" (a,="" b)="" gsk3b="" un="" aktivētā="" gsk3b="" noteikšana="" urīna="" atslāņotās="" šūnās,="" kas="" savāktas="" no="" agrīnas="" stadijas="" diabēta="" pacientiem="" (pts)="" un="" veselām="" kontrolēm="" (ctrl).="" ar="" urīnu="" izdalītās="" šūnas="" tika="" savāktas="" un="" lizētas.="" šūnu="" lizāti="" tika="" apstrādāti="" imūnblota="" analīzei="" gsk3b,="" p-gsk3b="" un="" gapdh.="" (c)="" imunobloti="" tika="" pakļauti="" densitometriskai="" analīzei.="" gsk3b="" un="" p-gsk3b="" relatīvais="" daudzums="" tika="" noteikts="" kā="" attiecīgās="" molekulas="" gapdh="" densitometriskās="" attiecības="" kā="" locījuma="" izmaiņas="" salīdzinājumā="" ar="" kontrolēm="" (ctrls).="" gsk3b="" relatīvā="" aktivitāte="" tika="" aprēķināta="" kā="" p-gsk3b="" attiecība="" pret="" gsk3b="" kā="" normālas="" kontroles="" krokas="" (ctrls).="" (d)="" uztvērēja="" darbības="" raksturlīknes="" analīze="" parādīja,="" ka="" relatīvā="" gsk3b="" aktivitāte="" (p-gsk3b/gsk3b="" attiecība)="" urīna="" atslāņotās="" šūnās,="" kas="" savāktas="" no="" agrīnas="" stadijas="" diabēta="" pacientiem,="" nodrošina="" izcilu="" precizitāti,="" prognozējot="" slimības="">diabētiskā nieru slimība5 gados, laukums zem līknes (AUC) ir 0,886.

ATSAUCES

1. Umanath K, Luiss JB. Atjauninājums par diabētisko nefropātiju: 2018. gada pamatizglītības programma. Am J Kidney Dis. 2018;71:884–895.

2. Gregg EW, Li Y, Wang J u.c. Ar diabētu saistīto komplikāciju izmaiņas Amerikas Savienotajās Valstīs, 1990-2010. N Engl J Med. 2014;370:1514–1523.

3. Haller H, Ito S, Izzo JL Jr u.c. Olmesartāns mikroalbuminūrijas aizkavēšanai vai profilaksei 2. tipa diabēta gadījumā. N Engl J Med. 2011;364:907–917.

4. Schena FP, Gesualdo L. Diabētiskās nefropātijas patoģenētiskie mehānismi. J Am Soc Nephrol. 2005;16 (pielikums 1):S30–S33.

5. Ritz E, Zeng XX, Rychlik I. Diabētiskās nefropātijas klīniskā izpausme un dabiskā vēsture. Ieguldījums Nephrol. 2011; 170:19–27.

6. Holman RR, Paul SK, Bethel MA u.c. 10-gadu pēc intensīvas glikozes kontroles 2. tipa diabēta gadījumā. N Engl J Med. 2008;359:1577–1589.

7. Perkins BA, Ficociello LH, Ostrander BE u.c. Mikroalbuminūrija un agrīnas progresējošas nieru darbības pasliktināšanās risks 1. tipa diabēta gadījumā. J Am Soc Nephrol. 2007;18:1353–1361.

8. Koye DN, Magliano DJ, Reid CM u.c. Normoalbuminuriskās CKD progresēšanas risks līdz beigu stadijas nieru slimībai cilvēkiem ar cukura diabētu: CRIC (hroniskas nieru mazspējas kohortas) pētījums. Esmu J Nieres Dis. 2018;72:653–661.

9. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Nepieciešamība pēc agrīniem diabētiskās nefropātijas riska prognozētājiem: vai albumīna izdalīšanās ātrums ir pietiekams? Diabēts. 2000;49:1399–1408.

10. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Zems glomerulārās filtrācijas ātrums normoalbuminuriska 1. tipa cukura diabēta pacientiem: progresīvāku glomerulu bojājumu rādītājs. Diabēts. 2003;52:1036–1040.

11. Krolevski AS. Progresējoša nieru mazspēja: jaunā diabētiskās nefropātijas paradigma 1. tipa diabēta gadījumā. Diabēta aprūpe. 2015; 38:954–962.

12. Robles NR, Villa J, Gallego RH. Neproteīniskā diabētiskā nefropātija. J Clin Med. 2015; 4:1761–1773.

13. Adler AI, Stevens RJ, Manley SE u.c. Nefropātijas attīstība un progresēšana 2. tipa diabēta gadījumā: Apvienotās Karalistes perspektīvais diabēta pētījums (UKPDS 64). Kidney Int. 2003; 63:225–232.

14. Gluhovschi C, Gluhovschi G, Petrica L u.c. Urīna biomarķieri agrīnas diabētiskās nefropātijas novērtēšanā. J Diabetes Res. 2016;2016: 4626125.

15. Doi T, Moriya T, Fujita Y u.c. Urīna IgG4 un Smad1 ir specifiski biomarķieri nieru strukturālajām un funkcionālajām izmaiņām diabētiskās nefropātijas sākumposmā. Diabēts. 2018; 67:986–993.

16. De S, Kuwahara S, Hosojima M, et al. Eksocitozes izraisīta urīna pilna garuma megalīna izdalīšanās ir saistīta ar diabētiskās nefropātijas patoģenēzi. Diabēts. 2017;66:1391–1404.

17. Xu W, Ge Y, Liu Z u.c. Glikogēna sintāzes kināze 3b nosaka podocītu kustīgumu un fokusa adhēzijas apgrozījumu, modulējot paksillīna aktivitāti: ietekme uz mazas litija devas aizsargājošo iedarbību podocitopātijā. Esmu J Pathol. 2014;184:2742–2756.

18. Ali A, Hoefiich KP, Woodgett JR. Glikogēna sintāzes kināze-3: īpašības, funkcijas un regulēšana. Chem Rev. 2001;101:2527–2540.

19. Beurel E, Grieco SF, Jope RS. Glikogēna sintāzes kināze-3 (GSK3): regulēšana, darbības un slimības. Pharmacol Ther. 2015; 148:114–131.

20. Li C, Ge Y, Dworkin L u.c. GSK3 b izoforma mediē podocītu autonomo bojājumu proteīnuriskā glomerulopātijā. J Pathols. 2016;239:23.