Ar iepriekšēju sagatavošanu aktivizēta AKT kontrolē neironu toleranci pret išēmiju, izmantojot MDM2–p53 ceļuⅠ

Abstrakts

Viens no svarīgākajiem iepriekšējas sagatavošanas mediētas neiroprotekcijas mehānismiem ir šūnu apoptozes pavājināšanās, izraisot smadzeņu toleranci pēc sekojošas traumējošas išēmijas. Šajā kontekstā antiapoptotiskajam PI3K / AKT signalizācijas ceļam ir galvenā loma šūnu diferenciācijas un izdzīvošanas regulēšanā.

Click to cistanche tubulosa pulveris forneiroaizsardzība

Ir zināms, ka aktīvais AKT palielina peles dubultminūtes-2 (MDM2) ekspresiju, E3-ubikvitīna ligāzi, kas destabilizē p53, lai veicinātu vēža šūnu izdzīvošanu. Neironos mēs nesen parādījām, ka MDM2 – p53 mijiedarbību pastiprina farmakoloģiska sagatavošana, kuras pamatā ir NMDA glutamāta receptoru subtoksiskā stimulācija, kas novērš išēmijas izraisītu neironu apoptozi.

Tomēr nav zināms, vai šis mehānisms veicina neironu toleranci išēmiskās sagatavošanas (IPC) laikā. Šeit mēs parādām, ka IPC izraisīja PI3K mediētu AKT fosforilāciju pie Ser473, kas savukārt fosforilēja MDM2 pie Ser166. Šī fosforilācija izraisīja MDM2 kodolstabilizāciju, izraisot p53 destabilizāciju, tādējādi novēršot neironu apoptozi išēmiska apvainojuma gadījumā. PI3K / AKT ceļa inhibīcija ar wortmannīnu vai AKT klusēšanu izraisīja citozola MDM2 uzkrāšanos, atceļot IPC izraisīto neiroprotekciju.

Tādējādi IPC uzlabo PI3K / AKT signalizācijas ceļa aktivizēšanu un veicina neironu toleranci, kontrolējot MDM2 – p53 mijiedarbību. Mūsu atklājumi nodrošina jaunu mehānisku ceļu, kas saistīts ar IPC izraisītu neiroprotekciju, modulējot AKT signālu, kas liecina, ka AKT ir potenciāls terapeitiskais mērķis pret išēmisku traumu. Atslēgvārdi: AKT; MDM2; p53; PI3K; išēmiskā tolerance; iepriekšēja sagatavošana

1. Ievads

Cilvēkiem pārejošas išēmiskas lēkmes (TIA) esamība ir atklāta kā endogēns priekšnosacījuma stāvoklis ar funkcionālo iznākumu priekšrocībām insulta pacientiem [1–3]. Endogēna neiroaizsardzība, ko izraisa īss, subtoksisks išēmisks stimuls, kas pazīstams kā išēmiska sagatavošana (IPC), tiek uzskatīta par stratēģiju jaunajā neiroaizsardzības jomā pret išēmiskiem bojājumiem [4–6].

Pierādījumi liecina, ka IPC veicināta neiroaizsardzība ir atkarīga no transkripcijas, translācijas un pēctranslācijas mehānismiem, kas maina galveno proteīnu darbību pēc išēmijas [6–11]. Tomēr mehānisms, kas saistīts ar IPC izraisītu išēmisku toleranci (IT), cilvēka smadzenēs nav pilnībā noskaidrots [12, 13].

Jaunu eksperimentālu pieeju izstrāde, lai izprastu IPC mediētu neiroprotekciju, ir spēcīgs instruments smadzeņu IT pamatā esošo endogēno mehānismu atšifrēšanai [6], kas var atklāt jaunus terapeitiskus mērķus, kuru mērķis ir samazināt smadzeņu bojājumus insulta pacientiem. Pēdējo divu desmitgažu laikā apoptotiskā neironu šūnu nāve ir pozicionējusies kā būtisks mehānisms, kas saistīts ar smadzeņu išēmisku traumu [14–16]. Šajā ziņā proteīna kināze B jeb AKT, serīna/treonīna kināze, kurai jāaktivizē funkcionāla fosfoinositīda kināze (PI3K), tika uzskatīta par būtisku mērķi neiroprotektīvai terapijai pēc išēmijas [17,18].

Nesen mēs parādījām, ka PI3K / AKT signalizācijas ceļa kavēšana palielina neironu jutību pret eksitotoksicitāti [19]. AKT ir iesaistīts kompleksā anti-apoptotiskā signalizācijas tīklā [20], kura komponenti var atrasties dažādās subcelulārās vietās atkarībā no audu veida [21,22]. Sirdī AKT ir bijusi iesaistīta iepriekšējas kondicionēšanas veicinātā kardioaizsardzībā [23].

Pierādījumi arī liecina, ka fosforilēts AKT veicina neironu izdzīvošanu smadzeņu išēmijas sākumā [24]. Lai gan AKT aktivācija var veicināt IT indukciju smadzenēs [25], precīzs mehānisms, kas saistīts ar tā IPC mediēto aktivāciju, joprojām ir nenotverams. Audzēja šūnās PI3K/AKT signalizācijas ceļa aktivizēšana noved pie MDM2 fosforilēšanās pie Ser166/186, kas veicina MDM2 [26,27] kodola translokāciju un uzlabo tā ubikvitinācijas aktivitāti [28].

Kodolā MDM2 saistās ar p53 un veicina tā ubikvitināciju un sekojošu proteasomu degradāciju, kas kavē p53 funkciju [29]. Stresa apstākļos p53 var izraisīt arī MDM2 pārmērīgu ekspresiju, kas, gluži pretēji, nomāc p53 aktivāciju negatīvās atgriezeniskās saites cilpā [30]. PI3K inhibīcija novērš AKT aktivāciju [31] un MDM2 fosforilēšanos iepriekš kondicionētā sirdī [32].

Šajā kontekstā mēs iepriekš noskaidrojām, ka in vivo smadzeņu sagatavošana samazināja infarkta apjomu pēc pārejošas vidējās smadzeņu artērijas oklūzijas (tMCAO), palielinot MDM2 proteīna līmeņa ekspresiju. Līdz ar to MDM2–p53 komplekss mazināja išēmijas izraisītu p53/PUMA/kaspāzes-3 signalizācijas ceļa aktivāciju primārajos kortikālajos neironos [33].

Šeit mēs izpētām PI3K / AKT signalizācijas ceļa lomu IPC mediētā neironu tolerancē pret sekojošu išēmisku traumu, kā arī pamatā esošo mehānismu, un mēs galvenokārt koncentrējamies uz iespējamo saikni starp AKT aktivāciju un MDM2 – p53 kompleksu. .

2. Rezultāti

2.1. IPC veicināta neiroaizsardzība

To veicina AKT fosforilēšana pie Ser473, MDM2 fosforilēšana pie Ser166 un p53 destabilizācija. Mēs iepriekš aprakstījām MDM2–p53 mijiedarbības ietekmi uz neironu jutību pret išēmiju [34] un IT [33]. Šeit mēs izpētījām AKT iespējamo lomu IPC mediētā neiroprotekcijā kā kandidātu, kas jāiesaista MDM2–p53 ceļā.

Pirmkārt, mēs apstiprinājām, ka išēmija veicināja AKT aktivāciju neironos, par ko liecina AKT fosforilācija pie Ser473. Kā parādīts 1A attēlā, īss (20 min) OGD ievērojami izraisīja p (Ser473) AKT un MDM2 ekspresiju, bet AKT proteīna līmenis palika nemainīgs (S1A attēls). Tomēr AKT fosforilācija netika novērota, kad neironi tika pakļauti ilgstošai OGD (90 minūtes). Turklāt MDM2 proteīna līmenis bija zemāks, kas atbilst augstākai p53 proteīna ekspresijai, kā parādīts 1A attēlā.

No laika atkarīga Mdm2 ekspresijas regulēšana pēc OGD (1.B attēls) apstiprina, ka subakūta išēmija var būt svarīga, lai izraisītu mehānismus, kas novērš p53 stabilizāciju pēc OGD, kā aprakstīts iepriekš [33]. Mēs izmantojām īsu OGD (20 min), kam sekoja 2 h reoksigenācija kā IPC modeli (S1B attēls) [33]; tādējādi mēs analizējām neironu ekstraktus, kas savākti 4 stundu laikā pēc reoksigenācijas pēc OGD (OGD / R) vai pēc OGD, pirms tam tika izmantots IPC protokols (IPC plus OGD / R). Paralēli neironi tika inkubēti normoksijas (Nx) vai iepriekšējas sagatavošanas (IPC) iestatījumos (S1B attēls).

Kā parādīts 1C un S1C attēlā, IPC izraisīja agrīnu AKT aktivāciju, kā to atklāja fosforilēšana pie Ser473 [35], kam sekoja MDM2 proteīna stabilizācija un fosforilēšana pie Ser166. IPC arī novērsa OGD/R izraisīto p53 stabilizāciju (1.C attēls). Interesanti, ka imunofluorescences attēli, kas parādīti 1.D attēlā, atklāja, ka IPC veicināja AKT fosforilēšanos pie Ser473 neironos, kas pārsvarā uzkrājās kodolā, un samazināja p53 stabilizāciju pēc OGD/R (IPC plus OGD/R), salīdzinot ar iepriekš nenoteiktiem neironiem (OGD). /R).

Līdz ar to IPC novērsa neironu apoptozi un kaspāzes -3 aktivāciju, ko izraisīja OGD/R, attiecīgi mērot ar plūsmas citometriju (S1D attēls) un fluorimetrijas testiem (S1E attēls). Lai apstiprinātu p53 lomu IPC mediētā neiroaizsardzībā, mēs izmantojām neironus, kas ekspresē (savvaļas tipa; wt) vai ne (knockout; ko) p53 proteīnu. Mūsu rezultāti liecina, ka neironi, kuriem trūkst p53 (S1F attēls), bija izturīgāki pret OGD izraisītu apoptozi nekā p53 wt neironi.

Turklāt apoptozes līmeņi p53KO neironos bija līdzīgi tiem, kas novēroti iepriekš sagatavotos (IPC plus OGD/R) wt neironos (S1G attēls), tādējādi apstiprinot p53 destabilizācijas galveno lomu IPC mediētā neiroaizsardzībā [33]. Mūsu rezultāti liecina, ka IPC izraisīja neiroprotekciju pret išēmisku apvainojumu, izmantojot mehānismu, kas ietver AKT fosforilāciju pie Ser473, MDM2 stabilizāciju un fosforilāciju pie Ser166 un p53 destabilizāciju.

2.2. IPC aktivizē MDM2 fosforilāciju pie Ser166, izmantojot PI3K/AKT ceļu

PI3K/AKT signalizācijas ceļš ir iesaistīts neironu IT gan in vitro [36], gan in vivo [37]. Tomēr IPC mediētās PI3K / AKT ceļa aktivācijas loma MDM2 – p53 kompleksa regulēšanā joprojām nav izpētīta. Lai to noskaidrotu, neironi tika inkubēti ar neatgriezenisku un specifisku PI3K/AKT ceļa inhibitoru wortmannin [19].

Kā parādīts 2.A attēlā, wortmannīns atcēla ar IPC uzlabotu (Ser473) AKT fosforilāciju un p53 destabilizāciju, kā parādīts 1.D attēlā. Šie rezultāti liecina par tiešu saikni starp AKT aktivāciju un p53-mediētās neironu apoptozes inhibīciju (S1D attēls) un kaspāzes-3 aktivāciju (S1E attēls), kas inducēta pēc OGD/R. Galvenais p53 stabilizācijas regulators MDM2 ir AKT mērķis [26], kas fosforilē MDM2 pie Ser166 un Ser186 [26]. PI3K inhibīcija ar wortmannīnu novērsa gan (Ser473)AKT, gan (Ser166)MDM2 fosforilēšanos, ko izraisīja IPC (2.B attēls).

Specifiskā Akt mediētā MDM2 fosforilācija pie Ser166, ko inducēja IPC, tika apstiprināta, izmantojot nelielu traucējošu RNS (siRNS), kas īpaši izstrādāta pret AKT1 proteīnu (siAkt), kas izteikti izteikta kortikālajos neironos un kuras aktivitāte ir būtiska neironu izdzīvošanai pēc išēmijas. 38]. Kā parādīts 3. attēlā, siAkt samazināja kopējo AKT un p(Ser473)AKT proteīna līmeni 3. dienā pēc transfekcijas gan HEK-293T šūnās (3.A attēls), gan garozas neironos (3.B attēls).

Turklāt AKT notriekšana (siAkt) novērsa (Ser166) MDM2 fosforilēšanos (3.B attēls). Šie rezultāti parāda, ka IPC aktivizētais PI3K / AKT signalizācijas ceļš veicina MDM2 fosforilēšanos pie Ser166, kas var būt atbildīgs par MDM2 stabilizāciju un no tā izrietošo p53 destabilizāciju pēc išēmiskas traumas.

2.3. IPC aktivētais AKT izraisa kodola MDM2 proteīna stabilizāciju pēc išēmijas

AKT aktivizēšana ir bijusi iesaistīta MDM2 kodola translokācijā audzēja šūnās [26]. Ņemot vērā MDM2 kodola stabilizācijas nozīmi neironu izdzīvošanai pēc išēmijas [34] un, konkrētāk, tās neiroprotektīvo lomu IPC [33], mēs nolēmām turpināt pētīt PI3K / AKT signalizācijas ceļa nozīmi MDM2 subcelulārās lokalizācijas regulēšanā. olbaltumvielas.

Tādējādi neironi vai HEK{0}}T šūnas tika transficētas ar cilvēka MDM2-marķētu proteīnu (MDM2-GFP). Reprezentatīvi transfektēto HEK-293T šūnu bloti un attēli no neironiem, kas ārpusdzemdes ekspresē cilvēka MDM2 proteīnu pēc četriem dažādiem eksperimentālajiem apstākļiem (Nx, IPC, OGD/R un IPC plus OGD/R) ir parādīti 4A un S1H attēlā. , attiecīgi.

MDM{0}} GFP ārpusdzemdes ekspresija apstiprināja, ka IPC veicina MDM2 kodola uzkrāšanos, salīdzinot ar iepriekš nenoteiktiem išēmiskiem (OGD/R) vai normoksiskiem (Nx) neironiem (4A un B attēls), kā liecina kodola/citozola fluorescences attiecības kvantitatīva noteikšana. (S2B attēls) un MDM2-GFP kodolfluorescences intensitāte (S2C attēls).

2.4. IPC veicina p(Ser473)AKT un MDM2 mijiedarbību, kas uzlabo MDM2 stabilizāciju kodolā un samazina inducēto neironu apoptozi pēc išēmijas

Pēc tam, kad tika demonstrēta ar IPC uzlabota PI3K / AKT ceļa aktivācijas loma MDM2 kodolstabilizācijā, mēs tālāk pētījām, vai p (Ser473) AKT un MDM2 mijiedarbojās kodolā (6.A attēls). MDM2 imunoprecipitācija no kodolproteīna ekstraktiem, kam sekoja imūnblotēšana pret MDM2 un p(Ser473)AKT, atklāja, ka IPC veicināja mijiedarbību starp p(Ser473)AKT un MDM2 pēc OGD/R, tādējādi novēršot OGD/R izraisītu kodola p53 stabilizāciju, kā parādīts kodola ievadē (6.A attēls).

Visbeidzot, mēs pētījām PI3K / AKT ceļa traucējumu kaitīgo ietekmi uz neironu apoptozi (6.B attēls). AKT inhibīcija neitralizēja IPC aizsargājošo iedarbību pirms OGD, kas apstiprina AKT – MDM2 neiroprotektīvo lomu IT kontekstā. Tādējādi mūsu rezultāti parāda, ka IPC izraisa AKT fosforilāciju un aktivizēšanu, kas veicina MDM2 fosforilāciju pie Ser166 un kodola translokāciju, kur tas mijiedarbojas ar p (Ser473) AKT. Šis mehānisms var veicināt pastiprinātu MDM2 kodolstabilizāciju, kam ir būtiska loma IPC izraisītā išēmiskā tolerancē.

Kā Cistanche aizsargā neironus?

Ir daži pierādījumi, kas liecina, ka Cistanche var aizsargāt neironus, samazinot apoptozi (ieprogrammētu šūnu nāvi) un veicinot neironu izdzīvošanu. Apoptoze ir dabisks process, kas notiek organismā, lai noņemtu bojātas vai nevēlamas šūnas, bet tas var būt kaitīgs, ja tas notiek pārmērīgi vai neatbilstoši. Laboratorijas pētījumos ir konstatēts, ka Cistanche inhibē apoptozi, un šī iedarbība var palīdzēt aizsargāt neironus no bojājumiem.

Turklāt Cistanche satur vairākus bioaktīvus savienojumus, kuriem ir pierādīta neiroprotektīva iedarbība. Piemēram, tas satur ehinakozīdu, kas, kā pierādīts, aizsargā neironus no oksidatīvā stresa un iekaisuma. Tas satur arī akteozīdu, kuram ir konstatētas pretiekaisuma un antioksidanta īpašības.

Turpinājums sekos...

Emīlija Bario 1,†, Rebeka Vecīno 1,2,†, Irēna Sančesa-Morāna 1, Kristīna Rodrigesa 1,2,3, Alberto Suaress-Pindado 1, Huans P. Bolanjoss 1,2,3,4, Andželosa Almeida 1, 2,3 un Marija Delgado-Estebana 1,2,3,*

1 Funkcionālās bioloģijas un genomikas institūts, Salamankas Universitāte, CSIC, 37007 Salamanka, Spānija; emibg7@gmail.com (EB); rebecavecino@usal.es (RV); irēne_sm@usal.es (IS-M.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (AS-P.); jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (AA)

2 Salamankas Biomedicīnas pētījumu institūts, Salamankas Universitātes slimnīca, Salamankas Universitāte, CSIC, 37007 Salamanka, Spānija

3 Bioķīmijas un molekulārās bioloģijas katedra, Salamankas Universitāte, 37007 Salamanka, Spānija 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Madride, Spānija} * Corres {5} ; Tālr.: plus 34-923-29-4908