Going Micro in leptospirozes nieru slimība Ⅱ

4. Saimnieka imunitātes reakcija uz Leptospira spp.

Galvenais Leptospira ceļš ir tieša iekļūšana gļotādās vai atvērtā ādā caur asinīm, audiem, urīnu vai piesārņotu ūdeni, kas izplatās pa sistēmisko cirkulāciju un izplatās vairākos orgānos, piemēram,aknas, plaušu un proksimālo kanāliņunefrons nierēs, kur tas var vairoties un izdzīvot mēnesi [51]. Sākotnējā infekcijas fāzē,iedzimta imūnreakcijaspēlē būtisku lomu kā pirmajai aizsardzības līnijai leptospirozes gadījumā, ietekmējot reakciju uzmodeļa atpazīšanas receptori, makrofāgu fagocitoze, ārpusšūnu indukcijaneitrofilu uzkrāšanās, unkomplementa sistēmas iejaukšanās [52].

Theimūnā atbildecilvēkiem ir būtiska lomaklīnisko pazīmju attīstība, tāpat kā dažu patogēno celmu virulences faktori. Lielākā daļa cilvēku leptospirozes ir asimptomātiskas vai vieglas, un tikai 10% gadījumu attīstās smagas formas ar vairāku orgānu mazspēju un paaugstinātu mirstības līmeni, kas saistīts arcitokīnu vētraun imūnparalīzes statuss. Patogēnās sugas stimulē humorālo reakciju bakterēmijas fāzē, lai gan turpmākā uzvedībaimūnā atbildeir neskaidrs. Pētījumos ar pacientiem ar vairākām leptospirozes klīniskām izpausmēm klīniskā attēla smagums ir saistīts ar dažādu seruma citokīnu līmeni, piemēram, TNF-, IL-10 un IL-6 [53], bet šis secinājums joprojām ir pretrunīgs [54]. Šie apstākļi ir palielinājuši interesi par imūnās atbildes reakciju kopumā un bioloģiskajiem notikumiem, kas rodas infekcijas laikā.

CIK ILGS PIEŅEM, LAI CISTANČE STRĀDĀS?

4.1. Leptospira un komplementu sistēma

Leptospirālo proteāžu proteolītiskā aktivitāte pret ekstracelulāro matricu ļauj infekcijai iekļūt asinsrites plūsmā. Komplementa sistēma asinsrites sistēmā ir viens no galvenajiem iedzimtas imūnās atbildes mehānismiem pret patogēno Leptospira. Tomēr Leptospira ir izstrādājusi stratēģijas, lai izvairītos no komplementa sistēmas uzbrukuma, saistot olbaltumvielas komplementa molekulām un ražojot proteāzes, piemēram, termolizīnu, termostabilu neitrālu metaloproteināzes enzīmu, kas ietekmē C3 proteīna ķēdi. Patogēnie celmi saistās ar H faktoru (FH), ar komplementa faktoru H saistīto proteīnu 1 (FHR-1), faktoram H līdzīgu proteīnu 1 (FHL-1) un C4b saistošo proteīnu (C4BP). no kuriem ir atbildīgi par komplementa sistēmas inhibīciju [55]. Ir trīs galvenās stratēģijas, lai izvairītos no patogēnas Leptospira [55,56] komplementa, traucējot saimnieka komplementa regulatorus, saimnieka proteāzi un baktēriju proteāzi. Komplementa regulatoriem Leptospira izmanto faktoru H (FH; alternatīva komplementa ceļa regulators) un C4 saistošo proteīnu (C4BP; klasisko un lektīna komplementa ceļu regulatoru), lai paātrinātu C3 konvertāžu samazināšanos un arī darbotos kā I faktora kofaktori. C3b un C4b šķelšanai [57,58]. Leptospirālais proteīns (LcpA) kopā ar vitronektīnu (Vn; termināla ceļa regulators) saista C9 un kavē tā polimerizāciju [59], tādējādi potenciāli bloķējot membrānas aktivējošā kompleksa (MAC) veidošanos [60]. Turklāt patogēnā Leptospira saista vairākas saimniekproteāzes, piemēram, urokināzes tipa plazminogēna aktivatoru (uPA), kas inducē aktīvo plazmīnu [61] (serīna proteāzi) C3b, C4b un C5 sagremošanai uz Leptospira virsmas [62]. Turklāt metaloproteāzes un termolizīns, endogēnā Leptospira proteāze, var sašķelt un inaktivēt vairākus komplementa proteīnus (C2, C3, C4 un faktoru B) [60]. Komplementa regulatoru kombinācija no saimnieka un patogēnās Leptospira atvieglo baktēriju kolonizāciju saimnieka mērķa orgānos [63].

4.2. Leptospira un neitrofīli

Infekcijas laikā Leptospira patogēnās sugas izraisa spēcīgu neitrofilu aktivāciju un pro-iekaisuma reakciju. Neitrofīli ir svarīgi mikroorganismu kontrolei, taču tie arī veicina audu bojājumus saimniekorganismā. Ir pierādīts, ka zems ārpusšūnu neitrofilu uzkrāšanās līmenis zemas neitrofilo leikocītu aktivitātes dēļ cirkulācijā palielina leptospirēmiju, norādot, ka neitrofilo leikocītu intravaskulāra veidošanās var būt izšķiroša, lai novērstu patogēnās Leptospira agrīnu izplatīšanos [64].

4.3. Leptospira un makrofāgi

Leptospira infekcijas sākotnējā fāzē makrofāgiem ir svarīga loma spirohetas likvidēšanā. Šis efektora mehānisms kopā ar efektīvu citokīnu reakciju ir saistīts ar fagocītu kontroli un infekcijas izplatību, lai gan Leptospira spp. Ir pierādīts, ka tas izraisa apoptozi makrofāgos, izmantojot Fas/FasL-kaspāzes-8/-3 ceļu, un veicina to izdzīvošanu un proliferāciju saimniekorganismā, jo inficētajos izdalās mitohondriju faktoru inducējošā apoptoze un endonukleāze. makrofāgi [65]. Nesenie pētījumi ir veikti par ar Leptospira inficēto makrofāgu mikrotranskriptu, lai noteiktu epiģenētiskos mehānismus, piemēram, RNS pēctranskripcijas regulēšanu. Makrofāgi, kas inficēti ar Leptospira, ir parādījuši, ka mikroRNS (miRNS) regulē infekcija ar spirohetu, parādot, ka šī regulēšana ir ļoti svarīga šo imūnsistēmas šūnu reakcijā Leptospira infekcijas gadījumā [66]. Cilvēka makrofāgos iekaisuma aktivācijai, ko izraisa reaktīvās skābekļa sugas un Leptospira infekcijas radītais lizosomu katepsīns B, ir ievērojams NLRP3 un IL-18 līmenis, kas veicina IL-1 veidošanos un izraisa augstu fagocitozes iespējamība un dažu citokīnu ātra modelēšana korelēja ar rezistenci pret leptospirozi [67].

4.4. Humorālā reakcija uz leptospiru

Specifisko humorālo reakciju pret Leptospira raksturo IgM un IgG antivielu veidošanās trešajā simptomu rašanās dienā. Turklāt ir ziņots par IgA veidošanos no pirmās dienas līdz devītajam mēnesim pēc inficēšanās; patiesībā IgM palielināšanās ir izmantota kā alternatīvs pasākums leptospirozes agrīnai diagnostikai [68]. Humorālās reakcijas ietekme cilvēkiem ar leptospirozi ļauj veikt seroloģisko diagnozi pēc dabiskas infekcijas [69]. Vissvarīgākais humorālās reakcijas aspekts Leptospira infekcijas gadījumā var būt aizsargājošu antivielu veidošanās. Pašlaik pieejamās vakcīnas pret leptospirozi sastāv no pilnīgiem šūnu preparātiem, un tām ir ierobežojumi, piemēram, zema efektivitāte, vairākas blakusparādības, zema imūnās atmiņas ģenerēšana un savstarpējās aizsardzības trūkums pret serovaru atšķirībām. Tādējādi slimību kontrolei ir nepieciešama jaunu vakcīnu izstrāde, un pašlaik tiek veikti pētījumi, lai ražotu vakcīnas no ģenētiskās imunizācijas [70]. Leptospira OMP ir uzskatīti par antigēnu ar labāku imunogenitāti B limfocītiem, kas ietver strukturālos epitopus OmpL187- 98, OmpL1173-191, OmpL1297-320, LipL4130-48, LipL{ {9}} un LipL41263-282 [71]. Šie epitopi ir daudzsološi kandidāti universālas vakcīnas izstrādei.

4.5. Adaptīvā imūnā atbilde uz Leptospira: T-šūnas un citokīni

Patogēnās Leptospira sugas izraisa imūnreakciju, ko mediē T un B limfocīti, ko papildina citokīnu ekspresija, kas var būt saistīta ar gravitācijas diagrammām. T šūnu aktivizēšana infekcijas laikā ar Leptospira ierosina iekaisuma reakciju, galvenokārt ar citokīnu ražošanu. Tas ir ļoti svarīgi infekcijas agrīnai likvidēšanai, taču nekontrolēta pro-iekaisuma citokīnu ražošana var izraisīt arī citokīnu pārprodukciju, kam seko imūnparalīze, kas var izraisīt sepsi un daudzu orgānu mazspēju. T limfocīti ražo IL-1, IL-6, IL-12, interferonu (IFN)- un TNF-, kas darbojas kā ķīmiski atraktanti, lai piesaistītu leikocītus infekcijas vietā. Interesanti, ka in ex vivo naivās δ T šūnas proliferējās perifēro asiņu mononukleāro šūnu (PBMC) kultūrās, kas stimulētas ar Leptospira antigēniem, kā arī ražoja gan IL-17, gan IFN [72]. Turklāt, lai gan ar leptospirozi inficētām savvaļas tipa pelēm bija augstāks daudz citokīnu, tostarp IL-4, IL-10 un IL-13, salīdzinot ar neinficētām pelēm, Leptospira izraisītas peļu hroniskas formas. nefrīts (Daf1-/- pelēm) uzrādīja augstāku gludās muskulatūras aktīna, IL-10, IL-13 ekspresiju, bet IL-12 un IL{{21} nebija atšķirības. } līmeņi [73]. Kā tādiem Daf1 un IL-17 var būt izšķiroša aizsargājoša loma HNS progresēšanā kā saikne starp Leptospira izraisītu peles HNS un nieru fibrozi [72,73]. Tomēr hipotēze par izvēlēto citokīnu reakciju slimības progresēšanā joprojām nav pārliecinoša cilvēka leptospirozes gadījumā. Pacientiem ar smagu leptospirozi un plaušu traucējumiem tika iegūts paaugstināts IL-6, CXCL8 un IL-10 līmenis, salīdzinot ar pacientiem ar vieglu leptospirozi [53]. Šīs augstās citokīnu koncentrācijas pacientiem ar leptospirozi izceļ to galveno lomu smagas leptospirozes attīstībā.

Pacientiem ar smagu infekciju tiek konstatēti CD4+ T limfocīti ar pro-iekaisuma profilu un IL-2 un IFN- ražotāji, savukārt CD4+ CD25 ir augsti IL-10 ražotāji. gandrīz nav. Šķiet, ka T limfocītu mediētās imūnās atbildes regulēšana nenovērš audu bojājumus, ko rada iekaisuma reakcija uz Leptospira. Cilvēku ar smagu leptospirozi CD4+ T limfocītos TNF un citu pro-iekaisuma citokīnu veidošanās ir lielāka nekā cilvēkiem ar vieglu slimības formu, kas liecina, ka šos citokīnus var izmantot kā marķierus. smagums infekcijas imunoloģiskajā fāzē [74]. IL-10 veidošanās ir saistīta ar nāves risku cilvēkiem ar leptospirozi; tomēr pētījums, kas tika veikts ar pakļautiem un asimptomātiskiem cilvēkiem, saistīja šī citokīna veidošanos ar iekaisuma reakcijas un izdzīvošanas kontroli [74]. Leptospira infekcijas laikā iekaisuma mediatori un dažu leikocītu šūnu, piemēram, T limfocītu, darbība tiek ātri regulēta rezistentiem indivīdiem, atšķirībā no tā, kas notiek indivīdiem ar smagām leptospirozes formām [75].

Rezumējot, imūnā atbilde uz Leptospira infekciju nav pilnībā izprotama leptospirozes pacientu klīniskās uzvedības dēļ, kuri mijiedarbojas ar dažādiem baktēriju genoma virulences faktoriem, kas Leptospira nodrošina stabilu patogēnu spēju.

5. Klīniskās izpausmes

Leptospirozes klīniskās izpausmes ir dažādas, sākot no viegliem, nespecifiskiem simptomiem, piemēram, gripai līdzīgiem simptomiem (drudzis, mialģija un galvassāpes), līdz smagiem simptomiem kopā ar orgānu bojājumiem beigu stadijā (piemēram, AKI, akūta aknu mazspēja , un asiņošanas diatēze, kas pazīstama arī kā Veila sindroms), akūta hemoptīze no plaušu asiņošanas, akūta apjukums no aseptiskā meningoencefalīta un akūta sirds mazspēja no akūta vai subakūta miokardīta [7]. Attiecīgi trīs iespējamās leptospirozes infekcijas indikatori sastāv no (i)akūta febrila slimība, (ii) dzelte un (iii)akūts nieru bojājums[12]. Smagas leptospirozes formas prognozes ir smaga mialģija sākumā, smaga asiņošanas tendence un izteikta dzelte. Interesanti, ka vai nu jau esošuhroniska nieru slimība(mazs nieres izmērs) vai palielinātas, pārslogotas nieres ar anūriju ir saistītas ar sliktāko iznākumu [12]. Tādējādi pacienti ar leptospirozi saistītu nieru slimību jāārstē nekavējoties.

6. Diagnostika

6.1. Klīniskā diagnoze

Leptospirozes diagnoze balstās uz iedarbības vēsturi, riska faktoriem un klīniskajām izpausmēm. Augsts aizdomu indekss var apiet vēlākus orgānu bojājumus. Tomēr leptospirozes simptomus bieži sajauc ar citiem akūta febrilā sindroma cēloņiem, piemēram, tropu drudža infekciju, malāriju, hepatītu un aktīvu autoimūnu slimību. Leptospirozes patognomonisko pazīmju trūkums nozīmē, ka diagnoze provizoriski balstās uz drudža un mialģijas novērtējumu pacientiem no endēmiskas zonas. Šī iemesla dēļ leptospirozes laboratoriskā diagnostika ir būtiska.

6.2. Laboratorijas diagnostika

Leptospirozi ir grūti diagnosticēt laboratoriski, īpaši akūtā fāzē. To var veikt, tieši identificējot spirohetas vai to sastāvdaļas ķermeņa šķidrumos vai audos, izolējot leptospirus kultūrā vai nosakot noteiktas antivielas dažādās klīniskajās fāzēs. Leptospirozi ir grūti atšķirt no tādām slimībām kā malārija, tropu drudzis, riketsija, gripa, hepatīts un dzeltenais drudzis tās neskaidra klīniskā izskata dēļ. Tā rezultātā, lai apstiprinātu diagnozi, ir nepieciešami laboratorijas testi. Šo testu (DNS) pamatā ir antivielu noteikšana pret leptospirām, pašām leptospirām vai to dezoksiribonukleīnskābi. Pašreizējā laboratoriskā diagnostika ietver gan tiešu identifikāciju (Leptospira spirohetu vai DNS noteikšana paraugos vai organisma izolēšanu no paraugiem), gan netiešo noteikšanu (seroloģiskā diagnoze vai seroloģija Leptospirālās infekcijas identificēšanai, kuras pamatā ir specifisku antivielu noteikšana pret dažādām slimībām). Leptospirālie antigēni) (1. tabula).

6.2.1. Tieša mikroskopiskā izmeklēšana, kultūra un antigēnu noteikšana

Leptospires ir plānas, spilgtas, aktīvi kustīgas spirāles ar raksturīgu ātru griešanos (raustīšanās kustīgumu) zem parastā tumšā lauka mikroskopa (DFM) un aptuveni 10 leptospiru/ml ir nepieciešami vienas šūnas noteikšanai katrā laukā. Ar vienu nedēļu ilgāk infekcijas ilgums ir aptuveni 10% mirušo DFM iznākumā (no 100 līdz 90%). Lai uzlabotu jutību, vairākas īpašas krāsošanas metodes; Warthin–Zvaigžņotā sudraba krāsošana [76] un imūnsistēma (imūnhistoķīmija, imunofluorescence, imūnmagnētiskā antigēna uztveršana un imūnoperoksidāzes krāsošana [77]), kam nepieciešamas serovaram specifiskas primārās antivielas (izolēti vai kombinācijā).

1. tabula. Laboratoriskie testi leptospirozes diagnostikai.

LAMP, cilpas mediēta izotermiskā pastiprināšana; PCR, polimerāzes ķēdes reakcija; NGS, nākamās paaudzes sekvencēšana; IHA, netiešā hemaglutinācija; ELISA, ar enzīmu saistīts imūnsorbcijas tests; IgM, imūnglobulīns M; MAT, makroskopiskā aglutinācijas pārbaude; MCAT, mikrokapsulu aglutinācijas tests; DNS, dezoksiribonukleīnskābe; DFM, tumšā lauka mikroskopija

Paralēli Leptospira kultūra no asinīm, urīna, cerebrospinālā šķidruma un biopsijas audiem ir iespējama pirmajās dienās līdz 10 dienām pēc slimības simptomu parādīšanās (leptospirozes stadija). Tā kā tie ir lēni augoši (6–8 h dubultošanās laiks), izsmalcināti un pakļauti kontaminācijai, kultūras paraugi ir jāglabā vismaz 3–4 mēnešus, pirms tos izmet kā negatīvus) ar tikai 23% jutību, bet tas ir nepieciešams. zāļu jutības testam [6]. EMJH (Ellinghausen–McCullough–Johnson–Harris) barotne (oleīnalbumīna komplekss) sastāv no liellopu seruma albumīna (frakcija V), Tween 80, amonija hlorīda tiamīna, monokālija fosfāta, dinātrija fosfāta un dažādu uzturvielu [78]. parasti izmanto, savukārt dažiem serovariem ir nepieciešama specializētāka T80/40/LH barotne (polisorbāts 40, laktalbumīna hidrolizāts, superoksīda dismutāze un truša serums) [79]. Šķiet, ka Hornsby–Alt–Nally (HAN) liela un daudzveidīga izsmalcinātu patogēno leptospiru klāsta primārajai izolācijai ir labs līdzeklis [80].

Leptospirālo antigēnu noteikšana ar imūnoperoksidāzi, imunofluorescenci vai imūnmagnētisko antigēnu uztveršanas sistēmu ir izstrādāta paraugiem ar zemu baktēriju daudzumu vai tumšā lauka mikroskopiju nevar izmantot, bet to neveic regulāri primāro antivielu ierobežojuma dēļ [77]. Turpretim nukleīnskābju atpazīšana ar jaunu DNS amplifikāciju; polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) (ti, ligzdotā PCR, kvantitatīvā PCR [qPCR]), cilpas mediētā izotermiskā amplifikācija (LAMP) un nākamās paaudzes sekvencēšana (NGS) ir vērtīga agrīnai un precīzai laboratorijas diagnostikai, īpaši ar Leptospira izolēšana, izmantojot bioloģisko barotņu inokulāciju un DNS hibridizāciju (DNS zonde) [81,82]. Diagnozei var pastiprināt dažādus leptospirālos mērķus (piemēram, 16S ribosomu RNS) vai DNS [83], un reāllaika PCR (RT-PCR) ir jutīgāka un specifiskāka nekā standarta PCR [84]. Tā kā daži RT-PCR primeri var saistīties ar nespecifisku vietu, izraisot kļūdaini pozitīvus rezultātus, jaunākās reāllaika multipleksās PCR pārbaudes ir izstrādātas, izmantojot divus primeru komplektus [85]. Nested PCR palīdz arī noteikt specifiskākas un jutīgākas DNS vietas, izmantojot papildu primeru komplektus [86,87]. Tomēr pašreizējās leptospirozes diagnostikas tendences ir gan seroloģisko, gan molekulāro metožu, piemēram, PCR un ELISA (vienkāršāka nekā zelta standarta seroloģiskā MAT) izmantošana valstīs ar ierobežotiem resursiem [88, 89]. Turklāt LAMP tehnika [90], lai noteiktu 16S rRNS gēnu (rrs), ir rentabla, ātra un augsta ienesīguma metode patogēno leptospiru noteikšanai urīnā. Pašlaik NGS ir visprecīzāk balstītā no kultūras neatkarīgā metode ķermeņa šķidrumos (asinīs un urīnā) kodola genoma analīzei [91], un turpmākais leptospirozes testu virziens būtu virzīties uz leptospiru molekulāro klasifikāciju, kas pārvar ierobežojumus. leptospiru kultūras izolācija no klīniskajiem paraugiem. Tādējādi PCR nozīme leptospirozes klīniskajā diagnostikā ir īpaši laba, un parādās vairākas modernas metodes.

6.2.2. Anti-Leptospira antivielu noteikšana

Tiek izmantotas vairākas seroloģiskās diagnozes; piemēram, ģints specifisko antivielu testi (netiešā hemaglutinācija [IHA], ar enzīmu saistītais imūnsorbcijas tests [ELISA], Lepto Dri Dot [lateksa aglutinācija], mikrokapsulu aglutinācija [MCAT]) un serovarspecifisko antivielu testi (mikroskopiskais aglutinācijas tests [). MAT]) [92,93]. Kā tādi MAT kritēriji diagnozei ir (i) četrkārtīgs titra pieaugums sapārotajos serumos (pašreizējās infekcijas serokonversija) vai (ii) viens augsts titrs (lielāks vai vienāds ar 1:400 vai 1:800, augstāks epidēmijas gadījumā zonās) (seropozitivitāte) (antivielas var saglabāties kādu laiku pēc inficēšanās vai krusteniski reaģēt ar citām slimībām). Turklāt MAT ir nepieciešams dzīvs visu reģionā esošo Leptospira serovaru panelis ar lokāli standartizētu serovaru paneli [93,94], kas atbilst Pasaules Dzīvnieku veselības organizācijai (19 antigēni, kas pārstāv 15 serogrupas) [95]. Tā kā antivielas ir nosakāmas 5–7 dienas pēc inficēšanās, MAT tests var būt negatīvs (titrs < 1:50) pirmajās infekcijas dienās. Leptospirozes diagnostiku var veikt, izmantojot urīna paraugus [96], izmantojot gan seroloģisko, gan molekulāro noteikšanu (16S rRNS), īpaši pacientiem ar nesenu infekciju (MAT, kas ir lielāks vai vienāds ar 1:800 vai ELISA IgM pozitīvs vai abi) [97] .

Ar ierobežotiem resursiem klīniskās prognozes rezultāts [98], kas balstīts uz attiecīgo klīnisko vēsturi un saistītajiem laboratorijas testiem ar punktu skaitu septiņos aspektos, ir šāds: hipotensija (3), dzelte (2), muskuļu sāpes (2), AKI (1,5). , tiek ierosināts zems hemoglobīna līmenis (3), hipokaliēmija ar hiponatriēmiju (3) un neitrofilija (1) (summētajam rezultātam 4 ir laukums zem uztvērēja darbības raksturlīknes {{10}}.78 ( 95% TI 0,68–0,89) leptospirozes diagnostikai [77]). Šis taju-Lepto uzņemšanas varbūtības rādītājs varētu būt diagnostikas instruments agrīnai iespējamai leptospirozes diagnostikai pacientiem, kuriem ir nopietnas klīniskas aizdomas par šo slimību.