lai iegūtu plašāku informāciju:ali.ma@wecistanche.com

II daļa: Nieru un ārpusnieru izpausmes cistinozes modelī pieaugušajiem zebras zivīm

2.3.5. Ctns−/− Zebrafish rada palielinātu radzenes biezumu

Cistinozeietekmē acis, izraisot cistīna uzkrāšanos vairākos audos, piemēram, varavīksnenē, konjunktīvā un tīklenes epitēlijā, tomēr radzene ir visvairāk skartā daļa cistīna uzkrāšanās dēļ [19], un tai ir palielināts biezums [20]. Izmantojot H&E krāsošanu, mēs atzīmējām, ka ctns−/−zebrafish uzrādīja lielāku radzenes stromas slāņa biezumu, salīdzinot ar savvaļas tipa (10.A, B, E) zebrazi. Tomēr mēs neatklājām acīmredzamas novirzes ctns−/−zebrafish tīklenes epitēlijā (10C, D attēls).

9. attēls. Vidējais peldēšanas ātrums savvaļas tipa un ctns−/−zebrafish. Vidējais ātrums ir samazināts ctns−/−zebrafish, salīdzinot ar savvaļas tipu abiem dzimumiem. Vidējais peldēšanas ātrums tiek mērīts pikseļos/sekundē. Katrs punkts apzīmē vienu zebrazi, kopā n=6 savvaļas tipa un n=6 ctns−/−18- mēnešus vecu zebrazi. Divvirzienu ANOVA ar Fišera mazākās atšķirības (PLSD) testu: ** p <>

1. attēls0. Acu histoloģija savvaļas tipa un ctns−/− zebrafish. (A, B) Savvaļas tipa (A) un ctns−/− (B) 18-mēnešus vecu zebrazivju radzenes reprezentatīvie attēli. Radzenes stromas slānis (melnas bultiņas un melnas līnijas). H&E krāsošana. Mēroga joslas ir 50 µm. (C, D) Savvaļas tipa (A) un ctns−/− (B) zebrafish tīklenes reprezentatīvie attēli. H&E krāsošana. Mēroga joslas ir 50 µm. (E) Radzenes stromas slāņa biezuma relatīvā kvantitatīva noteikšana. Katrs punkts apzīmē vienu radzenes stromas slāņa biezuma izdomājumu. Nepāra t-tests ar Velča korekciju, divpusējs: * p <>

2.3.6. Papildu Ctns−/− Zebrafish fenotipi

Papildus iepriekš minētajiem fenotipiem mēs veicām smadzeņu un olnīcu histoloģisko analīzi, neatklājot atšķirības starp zebrām un savvaļas tipa zebrām. Turklāt mēs novērtējām ctns−/− un savvaļas tipa zebrazivju ķermeņa garumu un svaru 18 mēnešu vecumā, un konstatējām palielinātu ķermeņa svaru, vienlaikus konstatējām palielinātu abu dzimumu ctns−/−zebras ķermeņa garumu, salīdzinot ar savvaļas tipa S1 attēls.

3. Diskusija

Pēdējo desmitgažu laikā,cistinozeir pārvērtusies no letālas bērnības slimības par ārstējamu vielmaiņas traucējumu, ar kuru pacienti var izdzīvot līdz pieauguša cilvēka vecumam un sasniegt augstu vecumu [21,22]. Ilgāka pacientu izdzīvošana atklāja jaunus slimību fenotipus un radīja jaunus jautājumus par terapijas patoģenēzi un ilgtermiņa ietekmi. Šajā sakarā arvien aktuālāka kļūst cistinozes pieaugušo dzīvnieku modeļu izpēte.

Pašreizējā pētījumā mēs pētījām nieru un ekstrarenālo cistinozīnas un pieaugušo zebras modeļa izpausmes 18 mēnešu vecumā, kas atbilst cilvēka vecumam no 40 līdz 50 gadiem [23,24]. Pirmkārt, mēs apstiprinājām, ka pieaugušo ctns−/− zebrafish modelis parāda visa ķermeņa un dažādu orgānu cistīna uzkrāšanos. Iekšnieres, histoloģiskā līmenī mēs novērojām PTEC bojājumu pazīmes, ko atspoguļo daudzu hialīnam līdzīgu eozinofīlo pilienu klātbūtne, citoplazmas vakuoli un daļēja suku robežu zudums. Turklāt ctns−/−zebras tēviņiem attīstījās glomerulārā hipertrofija. Visbeidzot, mēs parādījām, ka šķeltās kaspāzes 3 ekspresija palielinājās ctns-/-zebrafish nieru PTEC, norādot, ka apoptoze ir iesaistīta zebras nefropātiskās cistinozes patoģenēzē. Kopšcistinozepacientiem ir arī ekstrarenāla izpausmēm, mēs pētījām ctns−/− mutācijas ietekmi citos orgānos mūsu zebrafish modelī. Interesanti, ka mēs atklājām, ka ctns-/-mutācija izraisīja ādas anatomijas traucējumus un ietekmēja auglību, kustību aktivitāti un acis.

Lizosomas ir intracelulārās gremošanas vietas, un tās tiek uzskatītas par būtiskām šūnu metabolisma koordinatorēm [25]. Tā kā lizosomu uzkrāšanās slimība, galvenā iezīmecistinozeir lizosomu cistīna uzkrāšanās [26,27]. Interesanti, ka mēs atklājām 54-kārtīgu cistīna palielināšanos visā18-mēnešu cistinozeszebras ķermenī, salīdzinot ar savvaļas tipu, savukārt mūsu iepriekšējā pētījumā [10] cistinozes zebrafijas kāpuri 6 dienas pēc apaugļošanas parādīja 13-reizes palielinājums. Kopumā šie dati liecina, ka cistīna zebras cistīna dzīves laikā uzkrājas. Šķidruma hromatogrāfija un masas spektrometrijas analīze ir apstiprinājusi, ka starp visiem orgāniem,nieresir vēlamā vieta cistīna uzkrāšanai. Ir ziņots par lizosomu pietūkumu un hialīnam līdzīgiem eozinofīliem pilieniem lizosomu iekšpusē ar cistīnu noslogotā PTEC [28, 29], un cilvēka biopsijās cistīna kristāli parādās kā polimorfas formas telpas intersticiālajos makrofāgos un PTEC citoplazmā [27]. Cilvēka audos cistīna uzkrāšanās un kristalizācija ir kumulatīvs process, kas notiek dzīves laikā. Cistīna kristāli netika atklāti ctns-/-zebrafish kāpuru stadijā [10], savukārt mūsu izmēģinājuma eksperimentos mēs atklājām, ka cistīna kristālu polimorfā forma parādās 3 un 6 mēnešu vecumā un ir skaidri redzama. 18- mēnešu vecumā, kas liecina par pakāpenisku cistinozes ietekmes pasliktināšanosnieres.

Noklikšķiniet, laiCistanche ietekme uz nieru slimībām

Lai novērtētu glomerulu histoloģiskās izmaiņas, mēs izmērījām Bowmana kapsulas virsmas laukumus, glomerulāro pušķi un Bowman ctns−/−zebrafish telpu uz PAS iekrāsotajām sekcijām. Mēs atklājām, ka ctns−/−zebrafish attīstīja glomerulāru hipertrofiju, kas liecina par hiperfiltrāciju. Vieglie glomerulārie bojājumi, kas novēroti zebrā, var būt saistīti ar zebras reģenerācijas spējunieres, spējot pievienot jaunus nefronus, kā arī labot esošos nefronus [30].

Papildus histoloģiskajiem bojājumiem ir pierādīts, ka cistīna uzkrāšanās aktivizē proteinkināzi, kas izraisa apoptozi PTEC[12]. Tādējādi mēs novērtējām šķelto kaspāzes -3 ekspresiju PTEC un atklājām, ka ctns−/−zebrafish palielināja kaspāzes-3 un kodola sadrumstalotību. Šķeltās kaspāzes -3 klātbūtne galvenokārt tika konstatēta šūnās, kas uzkrāja citoplazmas vakuolus, kas liecina, ka ievainotajā PTEC notiek apoptoze. Viens papildu mehānisms, kas var izskaidrot palielināto apoptozi, varētu būt reaktīvo skābekļa sugu klātbūtne samazināta glutationa dēļ, kas saistīts ar cistīna uzkrāšanos [31]. Tomēr ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai novērtētu, vai šis mehānisms notiek arī ctns−/−zebrafish.

Lai gannieresir pirmie un vissmagāk skartie orgāni,cistinozeir multisistēmiska slimība, kurā tiek iesaistīti dažādi orgāni, piemēram, āda, dzimumdziedzeri, acis un muskuļi. Literatūrā ir zināms, ka cistinozes pacientiem bieži ir priekšlaicīga ādas novecošanās, gaiši mati un gaiša ādas krāsa [13]. Pēdējais fenotips ir saistīts ar cistinīna transportētāja iesaistīšanos melanīna sintēzes regulēšanā[32] un tumšākas pigmentācijas uzturēšanu, izmantojot jaunatklāto cisteīna transportētāju MFSD12 [33]. Aizraujoši, mūsu pieaugušajam ctns−/−zebrafish modelim bija hipopigmentēts un plankumains ādas modelis, kā arī traucēta melanīna izplatība, kas netika novērota kāpuru stadijā [10].

Papildus,cistinozeizraisa neauglību vīriešiem, savukārt ir zināms, ka sievietes ir auglīgas [14]. Jaunākie dati liecina, ka neauglību var izraisīt progresējoša sēklinieku deģenerācija, kas izraisa spermas kvalitātes izmaiņas, vai obstrukcija nenoteiktā vīriešu ekskrēcijas sistēmas daļā. Aizsprostotās struktūras var ietekmēt spermas kvalitāti, īpaši reģionos, kur kanāliem ir ļoti mazs diametrs, piemēram, retetestis[16]. Inzebrafish, spermatozoīdi ģenētiskajā procesā ir ļoti līdzīgi zīdītājiem; tomēr viena no galvenajām atšķirībām ir tā, ka cistās notiek spermatoģenēze [34]. Mūsu pētījumā mēs konstatējām palielinātu spermatozoīdu skaitu ctns−/−zebrafish spermatogēnajā cistā, tomēr mēs neatradām sēklinieku deģenerācijas pazīmes. Tāpēc aprakstītais fenotips varētu liecināt par obstrukciju sēklinieku līmenī, kas izraisa mazāku spermatozoīdu izdalīšanos vidē, tomēr ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai apstiprinātu šo hipotēzi. Funkcionālā līmenī samazināts olu skaits un samazināts apaugļoto olu skaits, šķiet, atspoguļo ctns−/−zebrafish auglības traucējumus.

Vēl viena klīniska izpausmecistinoze, kas parasti skar pacientus, sākot no otrās dzīves desmitgades, ir miopātija, ko raksturo muskuļu vājums un vājums [1]. Interesanti, ka mēs noskaidrojām, ka ctns-/-pieaugušajiem zebraziviem ir samazināta lokomotorā aktivitāte, salīdzinot ar kontroli, kas liecina par vājinātu muskuļu darbību. Jāatzīmē, ka šis fenotips nebija sastopams kāpuriem [10], kas liecina, ka tas ietekmē ctns−/−zebrafish vēlākā slimības stadijā. Neskatoties uz to, muskuļos netika konstatētas redzamas histoloģiskas atšķirības. Lokomotorās aktivitātes samazināšanās varētu būt saistīta ar mitohondriju disfunkciju, ko nevarēja noteikt ar rutīnas histoloģijas pētījumiem [35–37]. Tādējādi visaptverošam mitohondriju raksturojumam cistinozes zebrafā ir nepieciešams turpmāks novērtējums.

Papildus iepriekš minētajiem fenotipiem vairāki pētījumi ir parādījuši, ka cistinozes pacientiem ir arī acu simptomi, piemēram, fotofobija un blefarospasms [1], un radzene ir viena no visvairāk skartajām acs daļām, kā rezultātā uzkrājas cistīna kristāli un palielinās biezums [20]. Tomēr maz ir zināms par radzenes palielinātā biezuma cēloņiem. Piemēram, tika ierosināts, ka aprakstītais fenotips ir saistīts ar subklīnisku epitēlija un/vai endotēlija šūnu disfunkciju, kas izraisa tostromaledēmu[20]. Mūsu pētījumā mēs noskaidrojām, ka ctns−/−pieaugušo zebrafish displejs ir palielināts radzenes stromas slāņa biezumā, norādot, ka mūsu modelim ir radzenes disfunkcijas pazīmescistinoze.

Cistanche parnieresfunkciju

Viena no galvenajām nepilnībām, kas jāaizpilda, lai iegūtu visaptverošu izpratnicistinozeir tāda dzīvnieku modeļa trūkums, kas pilnībā atspoguļotu cilvēka slimību. Ir izstrādāti vairāki peļu modeļi, kas parāda cistīna uzkrāšanos, bet nespēj reproducēt visunierufenotips [8,26]. Konkrēti, C57BL/6 pelei bija cistīna uzkrāšanās vairākos orgānos, kas palielinās līdz ar vecumu [8]. Turklāt peles C57BL/6 modelī ir redzami proksimālie cauruļveida bojājumi, sākot no 6 mēnešu vecuma. Tāpat mūsu modelī proksimālie cauruļveida bojājumi laika gaitā pasliktinās. Tomēr glomerulārā līmenī peles C57BL/6 modelim bija normāls fenotips, savukārt mūsu pieaugušo zebrafish modelis uzrāda glomerulāru hipertrofiju. Turklāt C57BL/6 peles modelis nespēj atdarināt cilvēkiem novēroto auglības traucējumus, savukārt ctns−/−zebrafish modelī ir spermatogēnas cistas, kas bagātinātas ar spermatozoīdiem, un samazināta olšūnu ražošana. Acu līmenī gan peles[38], gan zebrazivju modelis uzrāda acs anomālijas. Gluži pretēji, ādas līmenī šim peles modelim nav traucēta melatonīna ražošana [8], kas pieauguša zebrafa modelī parādās kā hipopigmentēts ādas modelis. Visbeidzot, uzvedības līmenī mūsu ctns−/− zebrafish modelis uzrāda samazinātu lokomotorisko aktivitāti, kas var būt saistīta ar traucētu mitohondriju funkciju vai to var izraisīt palielināta ķermeņa masas sekundāra ietekme.cistinozezebrafish. Kopumā šķiet, ka mūsu ctns−/− zebrafish modelis labāk apkopo cilvēka slimību. Nesen Shimizu et al. izveidoja jaunu iedzimtu Ctnsugl mutāciju žurku celmā, kas tika parādītsnierubojājumi un cistīna kristāli lizosomāsnieresgaroza [7]. Tomēr joprojām trūkst detalizētāka modeļa raksturojuma. Tāpēc ir steidzami jāizstrādā un jāraksturo jauni funkcionālie modeļi, kas apkopo cilvēku slimības.

Noslēgumā mēs parādījām, ka mūsu pieaugušo ctns−/− zebrafish modelis atveido vairākus cilvēka cistīna smilšu kastes fenotipus var būt noderīgs, lai pētītu slimības patoģenēzi pieaugušajiem un pārbaudītu jaunu zāļu ilgtermiņa iedarbību nieru un ārpuskopienas koriģēšanai.nieruizpausmēm.

4. Materiāli un metodes

4.1. Zebras kopšana un audzēšana

Zebrafish tika apstrādāts un uzturēts saskaņā ar KU Lēvenas dzīvnieku labturības noteikumiem (Ētiskais apstiprinājums Nr.142/2019). Šajā pētījumā mēs iekļāvām ctns−/−zebrafish 18 mēnešu vecumā un savvaļas tipa kontroles zebrafish abiem dzimumiem. Sīkāka informācija par ctns−/−zebrafish ģenerēšanu tika aprakstīta mūsu iepriekšējā pētījumā [10].

4.2. Cistīna mērīšana

Cistīna līmenis tika mērīts zebrā (savvaļas tipa zivs,n=3un ctns−/−vīrišķās zivis, n=3), un daudzums tika izteikts kā nmol/mg proteīnu. Vispirms zebrazi nogalināja, iegremdējot trikaīna metānsulfonātā MS-222 (300 mg/L), pēc tam audu paraugus apstrādāja ar ultraskaņu 200 µL 5 mM N-etilmaleimīda (NEM, Sentluisa, MO, ASV, Sigma-Aldrich E3876) Dulbecco fosfātu buferšķīdumā (PBS), maksimāli 200 mg audu katram lizātam. Pēc tam katram homogenātam pievienoja 100 µL 12 procentu sulfosalicilskābes (SSA) un paraugus centrifugēja ar ātrumu 12,000 g 10 minūtes, 4 °C. Supernatanti, kas satur cistīnu, tika uzglabāti -80 ◦ C temperatūrā līdz analīzes brīdim, savukārt granulas tika izšķīdinātas nakti 4 ° C temperatūrā 300 µl 0, 1 M NaOH un tika turētas -80 ◦ C temperatūrā, līdz tika mērīts proteīns, izmantojot Pierce BCA Protein Assay Reagent Kit. Pēc tam cistīna daudzums (nmol) tika normalizēts līdz proteīna daudzumam (mg) no katra parauga. Pēc tam 50 µl augšējo daļu, kas satur cistu, pievieno 50 µL iekšējā standarta šķīduma (Cystine d6) un 5 s vorteksa; pēc tam maisījumu ekstrahēja ar 200 µL acetonitrila, maisīja vorteksā 30 sekundes un pēc tam centrifugēja pie 16,000 g 9 minūtes. Šķidruma hromatogrāfiju un masas spektrometrijas analīzi veica UHPLCAgilent1290InfinityII6470 (Agilent technology, Santa Clara, CA, USA), kas aprīkots ar ESI-JET-STREAM avotu, kas darbojas pozitīvo jonu (ESI plus) režīmā. Šī aprīkojuma vadībai un datu analīzei izmantotā programmatūra bija MassHunter (darba stacija Agilent Technologies, Barselona, ​​Spānija). Izmantotā atdalīšanas kolonna bija InfinityLab Poroshell 120 HILIC 1,9 µm 100 × 2,1 mm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ASV).

4.3. Hematoksilīna un eozīna un periodiskā skābes maiņas krāsošana

Zebrafish (savvaļas tipa zivju mātīte, n=3; savvaļas tipa zivju tēviņi, n=3; ctns−/−zivs mātīte, n=3; ctns−/−vīrišķā zivs, n=3) tika upurētas, iegremdējot trikaīna metānsulfonātā MS-222 (300 mg/L), pēc tam visa zebrazis tika fiksēta 4% buferētā paraformaldehīdā (4% PFA) 4 ◦C temperatūrā 1 nedēļu. . Pēc divreiz mazgāšanas ar PBS, zebrazis tika pārnestas uz EDTA šķīdumu (100 mM, pH=8) atkaļķošanai vēl 1 nedēļu, kam sekoja iestrādāšana parafīnā. Leicamikrotomā (LeicaBiosystems, Wetzlar, Vācija) izgriezts parafīnā iestrādāts zebras audi (biezums 4-µm). Sekcijas tika iekrāsotas ar H&E un PAS saskaņā ar standarta protokoliem.

Zebrazivju (savvaļas tipa mātīšu, n=3un ctns−/−zivju mātīšu, n=3) histoloģiskajos pētījumos acis tika izņemtas un fiksētas 4% PFA istabas temperatūrā 4 stundas. Optimālas griešanas temperatūras vidē (Tissue-Tek® VIP®; Sakura Finetek, Japāna) tika veiktas 10-µm kriosekcijas (Cryostar NX70, Thermofisher Scientific, Tokija, Japāna). Sekcijas tika iekrāsotas ar H&E saskaņā ar standarta protokoliem. Attēli tika izgatavoti ar Leica spilgtā lauka mikroskopu (Leica DM6, Wetzlar, Vācija).

4.4. Imūnhistoķīmija (šķeltās kaspāzes-3 krāsošana)

Sekcijas ar svaigi grieztiem zebras audiem tika deparafinētas un rehidrētas. Sekcijas tika pakļautas karstuma izraisītai antigēna iegūšanai, izmantojot 10 mM citrāta buferšķīdumu (pH=6). Pēc bloķēšanas ar 5 procentiem normālu kazas serumu (NGS) dPBS, sekcijas tika inkubētas ar trušu anti-šķelto kaspāzi-3 (Cell Signaling, Danvers, MA, ASV, atšķaidījums 1:200), kam sekoja anti-truša. -Envision, ar HRP iezīmēta sekundārā antiviela (Dako Products, Agilent, Santa Clara, CA, ASV). Kā negatīva kontrole tika izmantots parasts truša serums. Kā hromogēns tika izmantots diaminobenzidīns (DAB, DAKO, Glostrup, Dānija). Pēc tam sekcijas tika iekrāsotas ar H&E, dehidrētas un uzstādītas.

Nieru slimības ārstēšana: Cistanche

4.5. Toluidīna zilā krāsošana un TEM

Zebrafishnieruaudi (savvaļas zebras tēviņi, n=3 un ctns−/−zebrafish tēviņi, n=3) tika savākti un fiksēti EM fiksācijas buferšķīdumā (1,5% glutaraldehīda/1% paraformaldehīda) . Pēc tam nieru audi tika pēcfiksēti ar 2,5% glutaraldehīda/1,2% akroleīna fiksācijas buferšķīdumā (0,1 mol/L kakodilāti, 0,1 mol/L saharoze, pH 7,4) un 1 osmija tetroksīda procentuālais daudzums un iestrādāts sveķos. Pusplānas sekcijas (0.5-µm biezums) tika iekrāsotas ar toluidīna zilo krāsu. Īpaši plānās sekcijas tika iekrāsotas ar uranilacetātu. Attēli tika savākti, izmantojot JEM-1200 EX transmisijas elektronu mikroskopiju (JEOL Ltd, Tokija, Japāna) ar dažādiem palielinājumiem.

4.6. Digitālā attēla analīze

Krāsotie priekšmetstikliņi tika digitalizēti, izmantojot Philips Ultra-Fast Scanner 1.6 RA (Philips, Eindhoven, Nīderlande)

4.6.1. Glomerulārās hipertrofijas analīze

Lai analizētu glomerulāro hipertrofiju zebrazi, uz PAS krāsotiem priekšmetstikliņiem tika mērīti Boumena kapsulas virsmas laukumi (µm2), Boumena telpa un glomerulārais pušķis. Tika iekļauti visi pieejamie glomeruli katrā sadaļā un izmērīti, izmantojot ImageJ programmatūru. Statistiskajai analīzei tika izmantots katras zebras mērījumu vidējais lielums.

4.6.2. Sašķeltas kaspāzes-3 izteiksmes analīze

Twoobserversscoredthecleavedcaspase-3expressioninthetubulesofeachzebrafish. The semiquantitative score was conducted on the three randomized tubular fields in each zebrafish(20×magnification). Thepercentageofcaspase-3positivearearelativetothetotal area of tubules was scored as 1 (negative staining), 2 (1–10% positive staining), 3 (10%–25% positive staining), 4 (>25 procenti pozitīvas iekrāsošanās). Statistiskajai analīzei tika izmantots katras zebras vidējā rezultāta vidējais rādītājs.

4.6.3. Radzenes stromas analīzes biezums

Zebrafish radzenes stromas biezums (10 reizes palielinājums) tika mērīts tādos pašos attālumos no acs centra, izmantojot ImageJ programmatūru zebrazim. Katram attēlam n=7 mērījumi dažādās vietās acs daļā (centrālajā, vidū, perifērijā) tika veikti gar radzeni ar intervālu 100 µM. Mērījumu vidējais rādītājs tika izmantots statistiskai analīzei.

4.7. Auglības pētījums

Auglība tika novērtēta, pārojoties zebras mātītēm un tēviņiem (savvaļas tipa zivju tēviņi, n=4 un savvaļas tipa zivju mātītes, n=6 un ctns−/−vīrišķās zivis, n=4 un ctns−/−mātītes, n=6) nārsta paplātē. Nākamajā rītā, stundu pēc gaismas, tika savākti embriji un reģistrēts kopējais saražoto olu skaits. Apaugļotās olas tika pārbaudītas un skaitītas no neauglīgām, izmantojot gaismas mikroskopiju. Audzēšana tika veikta n=7 reizes reizi nedēļā pēc kārtas. Tika izslēgti divi eksperimenti, kuru rezultātā netika ražotas olas vienlaicīgi gan savvaļas tipa, gan ctns−/−zebrafish.

4.8. Lokomotora darbība

Zebrafish (savvaļas tipa zivju mātīte, n=6; savvaļas tipa zivju tēviņi, n=6; ctns−/−zivs mātīte, n=6; ctns−/−vīrišķā zivs, n=6) tika ievietoti parastajos mājokļos un pēc 5 minūšu adaptācijas laika tika filmēti 5 minūtes. Video ierakstīšana tika veikta, izmantojot GoPro® HERO 7, kas novietots tvertnes augšpusē, tādējādi nodrošinot peldošo zivju skatu no augšas. Izšķirtspēja un kadru ātrums tika iestatīti attiecīgi 1080 p (1920 × 1080) un 30 kadri sekundē. Videoklipi tika analizēti, izmantojot idTracker.ai, izsekojot indivīda zebras trajektorijas visā eksperimentā. Pēc tam trajektorijas tika analizētas ar pielāgotu pitona kodu, lai iegūtu vidējo kustības ātrumu (pikseļi/s) katrā grupā [39].

Cistanche-renāls

4.9. Ķermeņa svara un garuma mērījumi

Zebras tika attīrītas, iegremdējot 300 mg/Loftricainemethanesulfonate MS-222. Pēc tam, kad tika pārbaudīts, vai nav reakcijas uz ārējiem stimuliem, eitanāzētās zebrazis tika novietotas uz papīra salvetes un žāvētas. Eitanāzētās zebras garums tika novērtēts, izmantojot suportu, mērot no mutes gala līdz astes kātam. Eitanāzētās zebras svars tika novērtēts ar analītisko skalu.

4.10. Statistiskā analīze

Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot SPSS (IBM, Ņujorka, NY, ASV) un GraphpadPrism (GraphPadSoftware, LaJolla). Divu grupu dati tika analizēti, izmantojot nepāra t-testu ar Velča korekciju, divpusēji. Divu kategorisku neatkarīgu mainīgo dati tika analizēti ar divvirzienu ANOVA ar Fišera mazākās atšķirības (PLSD) testu. Atšķirības ar p < 0,05="" tika="" uzskatītas="" par="" statistiski="">

4.11. Auglības pētījums

Lai salīdzinātu olu ražošanas ātrumu starp savvaļas tipa un ctns−/−zebrafish, tika veikta Puasona regresijas analīze, izmantojot vispārinātus novērtēšanas vienādojumus ar spēcīgām standarta kļūdām, lai ņemtu vērā likmju korelāciju ar eksperimentiem. Lai salīdzinātu izredzes piedāvājumu, tika izmantotas olas starp savvaļas tipa un ctns−/−zebrafish Alogistic regresijas analīze, izmantojot Generalized Estimating Equations ar robustām standarta kļūdām, lai ņemtu vērā izredzes korelāciju eksperimentos.

Papildu materiāli: šādi ir pieejami tiešsaistē vietnē https://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms22179398/s1.

Autora ieguldījums: konceptualizācija, SPB, JH, LvdH, HJB, EL; metodoloģija, SPB, JH, LDG, HT, TN, PB, SC, BG; programmatūra SPB, JH, LDG, HT, TN; validācija, SPB, JH, LDG, PB, LvdH, HJB un EL; formālā analīze, SPB, JH, LDG, HT, TN; izmeklēšana, LvdH, HJB, EL; resursi, HJB un EL; datu pārvaldīšana, SPB, JH, LDG, LvdH, HJB, EL; rakstīšana-oriģinālā projekta sagatavošana SPB, JH; rakstīšana-recenzēšana un rediģēšana, LvdH, HJB, EL; vizualizācija, LvdH, HJB, EL; uzraudzība, PdW, LvdH, HJB, EL; projektu administrēšana, LvdH, HJB, EL; finansējuma iegūšana, HJB, EL Visi autori ir izlasījuši un piekrituši publicētajai manuskripta versijai.

Finansējums: autori vēlētos saņemt KULeuvenC1GranttoE.L iekšējo finansējumu. (C14/17/113), Ķīnas stipendiju padomes dotācija JH (CSC n◦ 201508500109) un FWO pēcdoktorantūras stipendija LDG (12I3820N).

Institucionālās pārbaudes padomes paziņojums: pētījums tika veikts saskaņā ar Helsinku deklarācijas vadlīnijām, un to apstiprināja KU Lēvenas Ētikas komiteja Nr. 142/2019. Pateicības: Mēs vēlamies pateikties: Didier Cagnini par smadzeņu histoloģijas novērtēšanu gan ctns−/−, gan savvaļas tipa zebrafā, Kathleeen Lambaerts, Frédéric Hendriks un KimvanKelst par viņu pastāvīgo atbalstu un palīdzību KU Lēvenas ūdens objektā, Peter Nees tehniskajam atbalstam. no TEM un Ronu Volterbēku statistikas analīzei.

Interešu konflikti: autori ir paziņojuši par interešu konfliktu. Līdzekļus izmantoja pētījuma noformējumā; datu vākšanā, analīzē vai interpretācijā; rokraksta rakstīšanā vai lēmumā par rezultātu publicēšanu.

Atsauces

1. Elmonem, MA; Vejs, KR; Soliman, NA; van Diks, M.; van den Heuvel, LP; Ļevčenko, E. Cistinoze: apskats. Orphanet J. Reti Dis. 2016, 11, 47. [CrossRef]

2. Jezegou, A.; Linaress, E.; Anne, C.; Kīfers-Jakinods, S.; O'Regans, S.; Aupetit, J.; Čabiss, A.; Sagne, C.; Debacker, C.; ChadefauxVekemans, B.; un citi. Heptahelical proteīns PQLC2 ir lizosomu katjonu aminoskābju eksportētājs, kas ir cisteamīna darbības pamatācistinozeterapija. Proc. Natl. Akad. Sci. ASV 2012, 109, E3434–E3443. [CrossRef] [PubMed]

3. Besouw, MT; Levtčenko, EN Nefropātiskās cistinozes prognozes uzlabošana. Int. J. Nefrols. Renova. Dis. 2014, 7, 297–302. [CrossRef]

4. Brodins-Sartoriuss, A.; Tete, MJ; Niaude, P.; Antignac, C.; Viesis, G.; Ottolenghi, C.; Šarbits, M.; Moyse, D.; Leģendrē, C.; Lesavre, P.; un citi. Cisteamīna terapija aizkavē nefropātiskās cistinozes progresēšanu vēlīnā pusaudža vecumā un pieaugušajiem. KidneyInt. 2012, 81., 179.–189. [CrossRef]

5. Cherqui, S. Cisteamīna terapija: cistinozes ārstēšana, nevis ārstēšana. Kidney Int. 2012, 81, 127–129. [CrossRef]

6. Dāvids, D.; Prinsjero Berlinžerio, S.; Elmonem, MA; Oliveira Arkolino, F.; Solimans, N.; van den Heuvels, B.; Gijsbers, R.; Levtčenko,E.Cistinozes molekulārais pamats: ģeogrāfiskais sadalījums, CTNS gēna mutāciju funkcionālās sekas un labošanas potenciāls. Nephron 2019, 141., 133.–146. [CrossRef] [PubMed]

7. Šimizu, Y.; Janobu-Takanaši, R.; Nakano, K.; Hamase, K.; Šimizu, T.; Okamura, T. Ctns gēna dzēšana izraisa nieru kanāliņu disfunkciju un cistīna uzkrāšanos LEA/Tohm žurkām. Mamm. Genoms 2019, 30, 23–33. [CrossRef]

8. Nevo, N.; Čols, M.; Beiljē, A.; Kalatzis, V.; Morisets, L.; Devuists, O.; Gublers, MC; Antignac, C. Nieru fenotipscistinozepeles modelis ir atkarīgs no ģenētiskā fona. Nefrols. Zvanīt. Transplantācija 2010, 25, 1059–1066. [CrossRef] [PubMed]

9. Elmonem, MA; Berlinžerio, SP; van den Heuvel, LP; de Vite, PA; Lovs, M.; Ļevčenko, EN ĢenētiskāNieruSlimības: Zebrafish modeļu jaunā loma. Cells 2018, 7, 130. [CrossRef] [PubMed]

10. Elmonem, MA; Halils, R.; Khodaparasts, L.; Khodaparasts, L.; Arkolino, FO; Morgans, Dž.; Pastore, A.; Tylzanovskis, P.; Ny, A.; Lovs, M.; un citi. Cistinozes (ctns) zebrafishmutants liecina par nefrisku glomerulu un kanāliņu disfunkciju. Sci. Rep. 2017,7, 42583. [CrossRef]

11. Lusco, MA;Najafian, B.;Alpers, CE;Fogo,ABAJKDANieru patoloģijas klase:Cistinoze. Am. J.KidneyDis. 2017,70,e23–e24. [CrossRef]

12. Parks, MA; Pejovičs, V.; Kerīsit, KG; Jūnijs, S.; Thoene, JG Paaugstināta apoptoze cistinotiskos fibroblastos unnieruproksimālās kanāliņu epitēlija šūnas rodas proteīnkināzes C delta cisteinilācijas rezultātā. J. Am. Soc. Nefrols. 2006, 17, 3167–3175. [CrossRef]

13. Vejs, KRP; Elmonem, MA; Dhenens, F.; Van Diks, M.; Jansens, M.; Kornelisens, EAM; Hohenfelners, K.; Reda, A.; Quatresoz, P.; van den Heuvels, B.; un citi. Uzlabota iekšējā ādas novecošanās nefropātiskās cistinozes gadījumā, kas novērtēta ar augstas izšķirtspējas optiskās koherences tomogrāfiju. J. Invest. Dermatol. 2019, 139, 2242–2245. [CrossRef]

14. Besouw, MT; Krēmers, JA; Jansens, MC; Levtchenko, EN Fertilitātes stāvoklis vīriešu cistinozes pacientiem, kuri ārstēti ar cisteamīnu. Auglīgs. Sterils. 2010, 93, 1880–1883. [CrossRef]

15. Vejs, KR; D'Hauvers, KW; van Dongens, A.; Jansens, MC; Besouw, MTP; Goossens, E.; van den Heuvel, LP; Wetzels, A.; Levtčenko, LV Pirmā veiksmīgā ieņemšana, ko izraisījis cistinozes pacients. JIMD Rep. 2018, 38, 1–6. [CrossRef] [PubMed]

16. Rohayem, J.; Hafners, D.; Cremers, JF; Huss, S.; Vistuba, J.; Veicels, D.; Klišs, S.; Hohenfellner, K. Sēklinieku funkcija vīriešiem ar infantilu nefropātisku cistinozi. Hum. Reproducēt. 2021, 36, 1191–1204. [CrossRef] [PubMed]

17. Bleikijs, H.; Prudfūts-Džounss, Dž. Noks, E.; Lipkin, G. Grūtniecība sievietēm ar cistinozi. Clin. Kidney J. 2019, 12, 855–858. [CrossRef]

18. Dogulu, CF; Tsilou, E.; Rubīns, B.; Ficgibona, EJ; Kaizer-Kupers, MI; Rennerts, OM; Gahl, WA Idiopātiska intrakraniāla hipertensija cistinozes gadījumā. J. Pediatr. 2004, 145, 673–678. [CrossRef] [PubMed]

19. Diksons, P.; Kristofers, K.; Chauhan, A. Stromas kolagēna iespējamā loma cistīna kristalizācijā cistinozes pacientiem. Int. J. Pharm. 2018, 551., 232.–240. [CrossRef]

20. Katz, B.; Melles, RB; Šneiders, JA; Rao, NA Radzenes biezums nefropātiskās cistinozes gadījumā. Br. J. Ophthalmol. 1989, 73, 665–668. [CrossRef] [PubMed]

21. Ņesterova, G.; Gahl, WA Cistinoze: ārstējamas slimības attīstība. Pediatr. Nefrols. 2013, 28, 51–59. [CrossRef] [PubMed]

22. Ariceta, G.; Džordāno, V.; Santos, F. Ilgstošas ​​cisteamīna terapijas ietekme pacientiem arcistinoze. Pediatr. Nefrols. 2019, 34, 571–578. [CrossRef] [PubMed]

23. Gilberts, MJ; Zerulla, TC; Tierney, KB Zebrafish (Danio rerio) kā paraugs novecošanas un fiziskās aktivitātes izpētei: fiziskās spējas un trenējamība samazinās līdz ar vecumu. Exp. Gerontols. 2014, 50, 106–113. [CrossRef] [PubMed]

24. Gerhards, GS; Kaufmans, EJ; Vangs, X.; Stjuarts, R.; Mūrs, JL; Kasales, CJ; Demidenko, E.; Cheng, KC Dzīves ilgums un novecojošie fenotipi divos Zebrafish celmos (Danio rerio). Exp. Gerontols. 2002, 37, 1055–1068. [CrossRef]

25. Saftigs, P.; Klumperman, J. Lizosomu bioģenēze un lizosomu membrānas proteīni: Trafficking meets function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2009, 10, 623–635. [CrossRef]

26. Čerki, S.; Sevins, C.; Hamards, G.; Kalatzis, V.; Sičs, M.; Pequignot, MO; Gogats, K.; Abitbols, M.; Brojers, M.; Gublers, MC; un citi. Intralizosomāla cistīna uzkrāšanās pelēm, kurām trūkst cistinozes, olbaltumviela ar cistinozes defektu. Mol. Šūna. Biol. 2002, 22, 7622–7632. [CrossRef]

27. Raggi, C.; Lučāni, A.; Nevo, N.; Antignac, C.; Terīns, S.; Devuyst, O. Dediferenciācija un endolizosomu nodalījuma aberācijas raksturo nefropātiskās cistinozes agrīno stadiju. Hum. Mol. Genet. 2014, 23, 2266–2278. [CrossRef]

28. Hard, GC Daži palīdz histoloģiski atpazīt hialīna pilienu nefropātijas deviņdesmit dienu toksicitātes pētījumos. Toksikols. Pathol. 2008, 36, 1014–1017. [CrossRef]

29. Sakarcāns, A.; Timmons, C.; Baum, M. Cistīna intracelulārais sadalījums cistīna ielādes proksimālajās kanāliņos. Pediatr. Res. 1994, 35, 447–450. [CrossRef]

30. Krogers, PT, Jr.; Vingerts, RA. Zebrafish izmantošana, lai pētītu podocītu ģenēzi nieru attīstības un reģenerācijas laikā. Genesis. 2014, 52, 771–792. [CrossRef]

31. Sumajao, R.; McEvoy, B.; Newsholme, P.; McMorrow, T. Lizosomu cistīna uzkrāšanās veicina mitohondriju depolarizāciju un redoksjutīgu gēnu indukciju cilvēka nieru proksimālajās kanāliņu šūnās. J. Physiol. 2016, 594, 3353–3370. [CrossRef]

32. Chiaverini, C.; Silards, L.; Flori, E.; Ito, S.; Briganti, S.; Vakamatsu, K.; Fontass, E.; Berārs, E.; Cailliez, M.; Čats, P.; un citi. Cistinozīns ir melanosomu proteīns, kas regulē melanīna sintēzi. FASEB J. 2012, 26, 3779–3789. [CrossRef]

33. Adelmann,CH;Traunbauer,AK;Chen,B.;Condon,KJ;Chan,SH;Kunchok,T.;Lewis,CA;Sabatini,DMMFSD12mediē cisteīna importu melanosomās un lizosomās. Daba 2020, 588., 699.–704. [CrossRef]

34. Leal, MC; Cardoso, ER; Nobrega, RH; Batlouni, SR; Bogerds, J.; Franca, LR; Schulz, RW Zebrafish (Danio rerio) spermatoģenēzes histoloģiskais un stereoloģiskais novērtējums, uzsvaru liekot uz spermatogonālajām paaudzēm. Biol. Reproducēt. 2009, 81, 177–187. [CrossRef] [PubMed]

35. Sansanvals, P.; Sarwal, MM. Patoloģiska mitohondriju autofagija nefropātijas gadījumācistinoze. Autofagija, 2010, 6, 971–973. [CrossRef] [PubMed]

36. Belomo, F.; Sinjorile, A.; Tamma, G.; Ranjēri, M.; Emma, ​​F.; De Rasmo, D. Netipiska mitohondriju cikliskā-AMP līmeņa ietekme nefropātijas cistinozē. Šūna. Mol. Life Sci. 2018, 75, 3411–3422. [CrossRef] [PubMed]

37. De Rasmo, D.; Sinjorile, A.; De Leo, E.; Poļiščuks, EV; Ferretti, A.; Raso, R.; Russo, S.; Poļiščuks, R.; Emma, ​​F.; Bellomo, F. MitochondrialDynamicsofProximalTubularEpithelialCellsinNephropathic Cystinosis. Int. J.Mol. Sci. 2019,21,192. [CrossRef]

39. Kalatzis, V.; Serratrise, N.; Hiperts, C.; Payet, O.; Arndt, C.; Cazevieille, C.; Moriss, T.; Hamels, C.; Malecaze, F.; Antignac, C.; un citi. Acu anomālijas cistinozes dzīvnieku modelī atdarina slimības patoģenēzi. Pediatr. Res. 2007, 62, 156–162. [CrossRef]

39. Romero-Ferero, F.; Bergomi, MG; Hincs, RC; Heras, FJH; de Polavija, GG idtracker.ai: visu indivīdu izsekošana mazos vai lielos nemarķētu dzīvnieku kolektīvos. Nat. Metodes 2019, 16, 179–182. [CrossRef]