Tetrandrīns mazina podocītu bojājumus, izmantojot no kalcija atkarīgo kalpaīnu-1 signalizācijas blokādi

Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com

Yin Ding, Xuanli Tang, Yuhui Wang, Dongrong Yu, Caifeng Zhu un Jin Yu*

Abstrakts

Fons:Podocīti ir kļuvuši par būtisku mērķi proteīnūrijas intervencēmnieresslimības. Daudzos pētījumos ir ziņots, ka pārejoša receptoru potenciāla katjonu kanāla proteīna 6 (TRPC6) pārmērīga ekspresija podocītu bojājumu gadījumā paaugstina intracelulāro Ca2 plus pieplūdumu un stimulē Ca2 plus atkarīgo proteāzes kalpaīna-1 signālu pārraidi. Tradicionālās ķīniešu zāles tetrandrīns, neselektīvs Ca2 plus kanālu blokators, jau sen ir izmantots hronisku slimību ārstēšanai.nieresslimība. Šī pētījuma mērķis bija izpētīt iespējamos mehānismus, kas ir pamatā tetrandrīna anti-proteinuriskajām īpašībām.

Metodes:Mēs pētījām tetrandrīna iesaistīšanos Ca2 plus atkarīgā kalpaīna-1 signalizācijā peles podocītu un adriamicīna izraisītas nefropātijas žurkām. Ciklosporīns A (CsA) un U73122 tika izmantoti kā pozitīvas kontroles. Tika pārbaudīta šūnu dzīvotspēja, citotoksicitāte, Ca2 plus koncentrācija, kalpaīna aktivitāte un mRNS un proteīnu ekspresijas līmeņi kalpaīna -1 signalizācijas ceļiem. Tika izmērītas klīniskās un patoloģiskās izmaiņas.

Rezultāti:Tetrandrīns samazināja intracelulāro Ca2 plus pieplūdumu kultivētos TRPC{1}}pārmērīgi ekspresējošos podocītos. Gan in vitro, gan in vivo pētījumos tetrandrīna ievadīšana samazināja kalpaīna aktivitāti un kalpaīna -1 ekspresiju un atjaunoja Talīna-1 un nefrīna ekspresiju. Salīdzinot ar CsA, tetrandrīna terapijai bija labāka inhibējoša iedarbība uz kalpaīna aktivitāti un kalpaīna -1 ekspresiju.

Secinājumi:Tetrandrīnam ir terapeitisks potenciāls podocītu bojājumu gadījumā, bloķējot no Ca2 plus atkarīgo kalpaīna-1 signalizācijas ceļa aktivāciju. Tetrandrīns samazināja proteīnūriju, uzlaboja nieru darbību un mazināja nieru patoloģiskos bojājumus.

Atslēgvārdi:Tetrandrīns, podocītu bojājums, pārejoša receptoru potenciāla katjonu kanāla proteīns 6, kalpaīns-1

Cistanche tubulosa novērš nieru slimību, noklikšķiniet šeit, lai iegūtu paraugu

Fons

Podocīti ir priekšnoteikums glomerulārās filtrācijas barjeras selektīvās caurlaidības un glomerulārās struktūras integritātes uzturēšanai. Podocītu bojājumi parasti ir saistīti ar proteīnuriskām nieru slimībām, tostarp fokālo segmentālo glomerulosklerozi (FSGS), membrānu nefropātiju, minimālu izmaiņu slimību un diabētu.nieresslimība [1–4]. Podocītu aizsardzība un atjaunošana no kaitīgiem faktoriem ir galvenais izaicinājums veiksmīgai nieru slimības ārstēšanai.

Podocīti ir ļoti specializētas, galīgi diferencētas šūnas, kas atrodas ārpus glomerulārās bazālās membrānas un kurām raksturīgi pēdas procesi. Kalcija signālu regulēšanas disfunkcija podocītos izraisa podocītu aktīna citoskeleta dezorganizāciju, pēdas procesa bojājumus, spraugas diafragmas traucējumus un proteīnūriju. Pārejoša receptoru potenciāla katjonu kanāla proteīns 6 (TRPC6), jauns ar spraugas diafragmu saistīts proteīns podocītos, ir identificēts kā nespecifisks Ca2 plus vadošs jonu kanāls [5–8]. Glomerulārā TRPC6 ekspresija ir palielināta daudzās iedzimtajās un iegūtajās proteīnuriskās slimībās. Iepriekšējie pētījumi ir ziņojuši, ka TRPC6 pārmērīga ekspresija podocītos izraisa izcilu intracelulārā Ca2 plus pieplūduma pieaugumu, kas, domājams, ir atbildīgs par podocītu šūnu bojājumiem. Palielināta kalcija slodze podocītos aktivizē pakārtotos signālu ceļus, tostarp kalpaīnu-1, talīnu-1, nefrīnu un kalcineirīnu, lai modulētu mērķa gēnu aktivitāti vai ekspresiju [9–12]. Fangji Huangqi Tang ir klasiska tradicionālā ķīniešu medicīna (TCM) nefrotiskā sindroma ārstēšanai [13]. Tas sastāv no sešiem augiem: Radix Stephania Tetrandra (Stephania tetrandra saknes), Radix Astragali (Astragalus membranaceus saknes), Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (Atractylodes macrocephaly saknes), Radix Glycyrrhizae (Zomacyrrhizae (Rhiiszlyencyrrhiisinga) (Zingiber Officinale saknes) un Fructus Ziziphi Jujubae (Fructus of Ziziphus jujuba) [1]. Tetrandrīns, viena no galvenajām aktīvajām Radix Stephania Tetrandra sastāvdaļām, kas ir neselektīvs Ca2 plus kanālu blokators, ir pārbaudīts klīniskajos pētījumos un ir indicēts proteīnūrijas mazināšanai un nieru darbības uzlabošanai [14, 15]. Iepriekšējais pētījums parādīja tetrandrīna bloķējošo ietekmi uz Ca2 plus atkarīgo RhoA signālu pārraidi podocītos [16], taču pamatā esošie mehānismi netika noskaidroti. Šeit tika izstrādāti TRPC{22}}pārmērīgas ekspresijas modeļi in vitro un in vivo. Pēc tetrandrīna ievadīšanas tika novērtētas TRPC6-atkarīgās Ca2 plus signālu izmaiņas, tostarp pakārtotie mērķi, kalpaīns-1, talīns-1, nefrīns un kalcineirīns. Kā pozitīvās kontroles tika izmantots ciklosporīns A (CsA), kalcineirīna inhibitors, ko plaši izmanto proteīnūrijas slimību ārstēšanā) [17] un U73122, TRPC6 kanāla atvēršanas inhibitors [18].

Metodes

Šūnu kultūra un plazmīdu uzbūve

Nosacīti iemūžinātas peles podocītu šūnu līnijas (MPC5) šūnas, kas iegūtas no profesora Pētera Mundela (Mount Sinai Medicīnas skola, ASV), proliferācijai tika uzturētas 33 grādos, un pēc tam diferenciācijai tika pārvietotas uz 37 grādiem. TRPC6 ekspresijas plazmīda tika izveidota, klonējot TRPC6 gēna kodējošās DNS sekvences pilnu garumu pCDH-GFP-PURO vektora EcoRI/BamHI vietās un iepakota lentivīrusā. Kad podocīti bija diferencēti un audzēti līdz aptuveni 80 procentiem saplūšanas, tie tika iesēti ar šūnu blīvumu 4 × 104 uz cm2 un inkubēti kombinācijā ar TRPC{11}}pārmērīgu lentivīrusu. Turpmākajos eksperimentos tika izmantota TRPC6 stabilā šūnu līnija, kas pārbaudīta, izmantojot TRPC6 proteīna un mRNS ekspresiju. Tus, MPC5 podocīti tika sadalīti trīs grupās: parastās kontroles (NC) grupā, tukšajā lentivīrusa (Lv-NC) grupā un TRPC6-pārāk ekspresējošā (OverTRP) grupā.

In vitro šūnu ārstēšana ar zālēm un citotoksicitātes tests

Šūnu dzīvotspēja tika iegūta, izmantojot šūnu skaitīšanas komplekta{{0}} (CCK-8) testu saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Kopā 5000 MPC5 podocīti katrā iedobē tika audzēti trīs eksemplāros 96-iedobju plāksnēs. Šūnas tika apstrādātas ar virkni CsA (0–2 μmol/L; Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO, ASV) un tetrandrīnu (0–40 μmol/L; Sigma Aldrich) 37 grādu temperatūrā 48 stundas. Pēc tam CCK-8 tika pievienots plāksnēm (10 μL/iedobē), kuras pēc tam inkubēja tumsā 2 stundas. Absorbcija pie 450 nm tika mērīta, izmantojot mikroplašu lasītāju (BioTek Instruments, ASV). Citotoksicitāte tika pārbaudīta, kvantitatīvi nosakot laktātdehidrogenāzes (LDH) izdalīšanos, izmantojot citotoksicitātes LDH testa komplektu-WST (Dojindo Laboratories, Japāna). Kā pozitīvu kontroli šūnas tika apstrādātas ar 10 μmol/LU73122 (Cal biochem, ASV) 37 grādu temperatūrā 10 minūtes.

RNS ekstrakcija un kvantitatīva reversās transkriptāzes-polimerāzes ķēdes reakcija (qRT-PCR)

Kopējā RNS tika sagatavota no kultivētām šūnām unnieresaudus, izmantojot RNAiso Plus reaģentu (Takara, Japāna) un reverso transkribēšanu cDNA PrimeScript™ RT Master Mix komplektā (Takara) saskaņā ar ražotāja protokolu. qRT-PCR tika veikta, izmantojot Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Vācija). Mērķa un atsauces gēnu primeru sekvences ir uzskaitītas S1 papildu tabulā. Dati tika savākti, izmantojot ABI Prism 7900HT FAST Real-Time PCR sistēmu. Mērķa gēna ekspresijas relatīvā kvantitatīvā noteikšana tika normalizēta, izmantojot salīdzinošo 2-ΔΔCt metodi. Kā iekšējā kontrole tika izmantota gliceraldehīda 3-fosfāta dehidrogenāze (GAPDH).

Western blotēšana

kopējie proteīna paraugi tika iegūti no kultivētām šūnām unnieresaudus. Olbaltumvielu koncentrācijas tika noteiktas, izmantojot BCA proteīna testa komplektu (Thermo Fisher Scientific). Paraugi tika atdalīti uz 10% nātrija dodecilsulfāta-poliakrilamīda gēla un pārnesti uz polivinilidēna difluorīda membrānu. Pēc tam membrāna tika bloķēta uz nakti 4 grādos ar primārajām antivielām, proti, anti-TRPC6 (Santakrusa, ASV), anti-cal sāpes-1 (Abcam, Apvienotā Karaliste), anti-Talin-1 (Abcam) , anti-nefrīns (Santa Cruz) un anti-kalcineirīns (Abcam). Pēc mazgāšanas membrāna tika inkubēta ar kazas antitrušu IgG (H plus L; Jackson ImmunoResearch Laboratories, ASV). Membrāna tika arī apstrādāta, lai noteiktu GAPDH (Abcam) vienādai slodzei. Primārās antivielas atpazītās joslas tika vizualizētas, un olbaltumvielu joslu optiskais blīvums tika analizēts, izmantojot programmatūru TanonImage (Tanon, Ķīna).

Citozola Ca2 plus noteikšana kultivētos podocītosMPC5 podocīti tika iesēti un apstrādāti ar tetrandrīnu, CsA un U73122 attiecīgi 48 stundas, 48 ​​stundas un 10 minūtes. Pēc tam podocīti tika inkubēti ar RPMI-1640, kas papildināts ar 10 μM Fluo-3AM (Dojindo Laboratories) 30 minūtes tumsā. Pēc tam tos nekavējoties nomazgāja ar fosfātu buferšķīdumu, kurā tos uzturēja un ierosināja pie 488 nm. Citozola Ca2 plus jonu relatīvā koncentrācija tika novērtēta, mērot fluorescences intensitāti, izmantojot Zeiss lāzera konfokālās attēlveidošanas sistēmu (Zeiss, ASV).

Kalpaīna aktivitātes mērīšana

Kalpaīna aktivitāte tika noteikta, izmantojot Calpain Activity Assay Kit no Abcam Inc., saskaņā ar ražotāja protokolu. Supernatants (150 uL) podocītu vainieresaudi tika ņemti atbilstošā buferšķīdumā (145 mmol/L Nacl, 100 mmol/L Tris-HCL, pH 7,3) un 0,15 ml-Succinyl-Leu-Tyr-AMC (500 umol/L). Pēc 1-h inkubācijas 37 grādu temperatūrā tumsā paraugi tika nolasīti, izmantojot fluorometru, kas aprīkots ar 360 nm ierosmes filtru un 440 nm emisijas filtru.

Adriamicīna izraisītas nefropātijas (ADRN) žurku modelis Pamatojoties uz parauga lieluma Fermi aproksimāciju [19] un proteīnūrijas atšķirību starp kontroles un modeļa grupām mūsu sākotnējos eksperimentos, tika noteikts kopējais mūsu pētījumā nepieciešamais žurku skaits. Kopumā 56 veseli Sprague-Dawley žurku tēviņi, kas sver aptuveni 200 g un bija aptuveni 8 nedēļas veci (Džedzjanas TCM institūts), tika nejauši sadalīti septiņās grupās (n =8 žurkas/grupa), proti, ADR grupa, ADR plus. tetrandrīna mazo devu grupa (4 mg/kg/d), ADR plus tetrandrīna vidējas devas grupa (8 mg/kg/d), ADR plus tetrandrīna lielas devas grupa (16 mg/kg/d), ADR plus CsA ārstēta grupa (30 mg /kg/d), ADR plus vidējā tetrandrīna deva (8mg/kg/d) kombinācijā ar CsA (30mg/kg/d) grupā un NC grupā. Žurkas modeļa grupā un narkotiku ārstēšanas grupās tika anestēzētas ar ketamīna hidrohlorīda (50 mg/kg) intraperitoneālu injekciju, un divas ADR devas (4 mg/kg) tika injicētas astes vēnā, lai izstrādātu FSGS žurku modeli. Pēc 12 nedēļām žurkām 24 stundas tika savākti urīna paraugi, izmantojot vielmaiņas būrus, kam sekoja asiņu savākšana un žurku raža.nieres. Tika novērota klīniskā efektivitāte, un izmaiņas 24-h urīna proteīna, plazmas albumīna, seruma kreatinīna (Scr) un asins urīna slāpekļa (BUN) līmeņos tika mērītas, izmantojot komerciāli pieejamus diagnostikas komplektus ar automatizētu ķīmijas analizatoru (HITACHI 7180). ).

Visas eksperimentālās procedūras, kas saistītas ar dzīvnieku izmantošanu, apstiprināja Džedzjanas TCM institūta (Tianmushan Road Nr. 132) Eksperimentu ar dzīvniekiem Ētikas komiteja, un tās tika stingri veiktas saskaņā ar principiem, kas izklāstīti NIH Laboratorijas dzīvnieku kopšanas un lietošanas rokasgrāmatā. .

Histoloģiskā krāsošana, elektronu mikroskopija un analīze

Žurkanierestika fiksēti paraformaldehīdā, dehidrēti, izmantojot klasificētu etanola sēriju, un iestrādāti parafīnā. Sekcijas (5- μm biezas) tika iekrāsotas ar hematoksilīnu un eozīnu (H&E) un Masona trihromu un pārbaudītas optiskā mikroskopā. Nieres tika perfūzētas un fiksētas ar glutaraldehīdu un pēc tam sagrieztas 1-mm3 audu blokos epoksīda iegulšanai. Elektronu mikroskopija tika veikta, izmantojot standarta procedūras. No katra parauga nejauši tika iegūti pieci ultramikrogrāfi. Podocītu pēdas procesu saplūšanas ātrums (PFR) tika aprēķināts, izmantojot šādu formulu: PFR ( procenti )=∑LFP / ∑LBM × 100 procenti , kur ∑LFP ir sapludinātās pēdas procesa kopējais garums un ∑LBM ir perifēro kapilāru bazālās membrānas (BM) kopējais garums.

Statistiskā analīze

Dati ir izteikti kā vidējā ± standarta mērījumu kļūda un analizēti, izmantojot SPSS 20.0 (IBM Statistics SPSS, ASV) un GraphPad Prism 6 for Windows (GraphPad Software Inc., ASV). Normālais sadalījums tika novērtēts ar qq diagrammām un SW testu. Dati liecināja par normālu sadalījumu. Salīdzinot divas datu grupas, tika izmantots neatkarīgo paraugu t-tests. Atšķirības starp trim vai vairākām neatkarīgām grupām tika salīdzinātas, izmantojot vienvirziena dispersijas analīzi, kam sekoja Tukey post hoc tests. Statistiskā nozīmība tika noteikta p<>

Rezultāti

Tetrandrīna, CsA un U73122 optimālo koncentrāciju un citotoksicitātes izvēle

Lai noteiktu šūnu dzīvotspēju, tika izmantots CCK{{0}} tests. Kā parādīts 1.a un b attēlā, maksimālā koncentrācija 10μmol/L tetrandrīna un 0.1μmol/L CsA neietekmēja MPC5 podocītu dzīvotspēju. LDH izdalīšanās tests arī apstiprināja, ka 10 μmol/L tetrandrīns un 0,1 μmol/L CsA 48 stundas neuzrādīja toksicitāti, savukārt 10 μmol/LU73122 10 minūtes uzrādīja paredzamo toksicitāti (1.c attēls). Tāpēc turpmākajos šūnu eksperimentos tika izmantots tetrandrīns un CsA attiecīgi 10 μmol / L un 0, 1 μmol / L.

Tetrandrīns samazināja intracelulāro Ca2 plus pieplūdumu kultivētajās MPC5 šūnās, kas pārmērīgi ekspresē TRPC6

Izmantojot plazmīdu transfekciju, tika veiksmīgi izveidots TRPC6 pārmērīgas ekspresijas šūnu modelis MPC5 podocītos. qRT-PCR un Western blot analīze parādīja, ka TRPC6 ekspresijas līmeņi Over-TRP grupā ievērojami palielinājās, salīdzinot ar NC un Lv-NC grupām (p<0.05; fig.="" 2a="" and="" b).="" and="" full-length="" gel="" and="" blot="" of="" trpc6="" were="" included="" in="" supplementary="" fig.="">

Fluorescences attēlveidošana (2.c att.) un daļēji kvantitatīvā analīze (2.d att.) liecināja, ka TRPC6 pārmērīga ekspresija pastiprināja intracelulāro Ca2 plus pieplūdumu, bet nebija acīmredzamu atšķirību starp NC un Lv-NC grupām. Pēc tam desmit OverTRP grupas šūnas tika apstrādātas ar eksperimentālajām zālēm. Zāļu pirmapstrādes grupām (tetrandrīns, CsA un U73122) bija inhibējoša ietekme uz intracelulāro Ca2 plus pieplūdumu (P<0.05), while="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" among="" the="" three="" groups="" of="">

Tetrandrīna ietekme uz kalpaīna-1, kalcineirīna, talīna-1 un nefrīna aktivitāti un ekspresiju MPC5 šūnās

Ir pierādīts, ka intracelulārais Ca2 plus aktivizē kalpaīnu, no Ca2 plus atkarīgo cisteīna proteāzi un kalcineirīnu, Ca2 plus/kalmodulīna atkarīgo proteīna fosfatāzi. Saskaņā ar iepriekšējiem novērojumiem kalpaīna un kalcineirīna aktivitātes un ekspresijas līmeņi Over TRP grupā bija augstāki nekā NC un Lv-NC grupās (p<0.05; fig.="" 3a-e,="" h="" and="" i).="" drop="" intervention="" in="" cultured="" trpc6-overexpressing="" podocytes="" established="" that="" tetrandrine="" inhibited="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" expression.="" te="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" mrna="" levels="" were="" significantly="" reduced="" in="" the="" tetrandrine-exposed="" group="" than="" in="" the="" csa="" intervention="" group=""><0.05; fig.="" 3a="" and="" d).="" western="" blotting="" results="" demonstrated="" a="" considerable="" decrease="" in="" calpain-1="" protein="" levels="" because="" of="" tetrandrine=""><0.05; fig.="" 3c="" and="" h).="" in="" addition,="" calcineurin="" activity="" was="" significantly="" reduced=""><0.05; fig.="" 3b)="" after="" tetrandrine="" exposure,="" but="" the="" mrna="" and="" protein="" expression="" levels="" of="" calcineurin="" remain="" unchanged="" (fig.="" 3e="" and="" i).="" treatment="" with="" csa="" did="" not="" block="" calpain="" activation="" (fig.="" 3a),="" and="" the="" effect="" was="" not="" as="" robust="" as="" that="" of="" tetrandrine="" in="" calpain-1="" mrna="" expression=""><0.05; fig.="" 3d).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 3b,="" e="" and="">

The podocyte cytoskeleton-associated anchoring protein Talin-1 and the slit diaphragm protein nephrin are two specific targets of calpain-1. When treated with tetrandrine, there was an increasing trend in mRNA and protein expression of Talin-1 (p >0.05) un nefrīns (lpp<0.05), compared="" with="" that="" in="" the="" overtrp="" group,="" but="" this="" finding="" was="" not="" statistically="" significant="" among="" the="" three="" treatment="" groups="" (p="">0.05; 3.f, g, j un k attēls).

Pilna garuma gēli un bloti tika iekļauti S1 papildu attēlā.

Eksperimenti in vivo, izmantojot ADRN modeli ar žurku Lai raksturotu reakciju uz tetrandrīna izraisītu TRPC6/kalpaīna-1 signālu inhibīciju in vivo, tika izstrādāts ADRN modelis žurkām. TRPC6 mRNS un olbaltumvielu ekspresijas profili bija ievērojami palielināti ADRN grupā, salīdzinot ar tiem žurkām, kas barotas ar parasto ēdu (NC grupa; p<0.05; fig.="" 4a="" and="" b).="" consistent="" with="" the="" above="" studies="" in="" cell-based="" models,="" the="" activity="" and="" expression="" levels="" of="" calpain="" and="" calcineurin="" increased="" remarkably="" in="" the="" adrn="" group=""><0.05; fig.="" 4c-g,="" j,="" and="" k)="" than="" in="" the="" nc="">

Ārstēšana ar CsA nebloķēja kalpaīna aktivāciju, ko izraisīja TRPC6 pārmērīga ekspresija (4.c att.), un ietekme uz cal pain-1 proteīna ekspresiju nebija tik spēcīga kā tetrandrīnam (p<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="" k).="" the="" tetrandrine="" group="" was="" down="" compared="" to="" the="" adr="" group="" (fig.="">

Ārstēšana ar CsA nebloķēja kalpaīna aktivāciju, ko izraisīja TRPC6 pārmērīga ekspresija (4.c att.), un ietekme uz kalpaīna-1 proteīna ekspresiju nebija tik spēcīga kā tetrandrīnam (p<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="">

Turklāt tika novērtēta Talīna -1 un nefrīna ekspresija (4.h, i, l un m att.). Gan Talīna-1, gan nefrīna līmenis ADRN žurkām bija samazināts, salīdzinot ar NC grupu (p<0.05). upon="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" mrna="" levels="" and="" protein="" expression="" of="" talin-1="" and="" nephrin="" were="" visibly="" increased.="" the="" high-dose="" group="" of="" tetrandrine="" recovered="" the="" expression="" of="" the="" two="" structural="" components,="" similar="" to="" the="" adr+csa="" group="" (p="">0.05).

Pilna garuma želejas un bloti tika iekļauti papildu attēlā S2.

Tetrandrīns nomāca ADRN progresēšanu un izglāba histopatoloģiju. Tetrandrīna ietekme uznieresPēc tam tika novērtēta funkcija Sprague-Dawley žurkām, kas tika ārstētas ar ADRN (5.a-d attēls). Sākotnēji nebija nozīmīgu atšķirību 24-h proteīnūrijas, Scr un BUN līmeņos starp grupām. Divpadsmit nedēļas vēlāk 24 stundu proteīnūrijas, Scr un BUN līmenis ADRN grupā tika statistiski paaugstināts, bet plazmas albumīna līmenis bija ievērojami samazināts, salīdzinot ar NC grupā (P<0.05). after="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" levels="" of="" proteinuria,="" scr,="" and="" bun="" were="" markedly="" decreased,="" whereas="" the="" level="" of="" albumin="" was="" significantly="" improved="" compared="" to="" those="" in="" the="" adr="" group=""><0.05). among="" the="" three="" dose-response="" subgroups="" of="" tetrandrine,="" a="" significant="" difference="" was="" observed:="" the="" middle="" dose="" demonstrated="" considerably="" better="" efficacy="" than="" the="" other="" two="" doses=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" levels="" of="" serum="" alanine="" aminotransferase,="" before="" and="" after="" treatment="" among="" groups="" (p="">0.05; dati nav parādīti).

Izmaiņas histomorfoloģijā parādītas 6. attēlā. ADRN žurkām H&E un Masson krāsošana uzrādīja FSGS, tubulointersticiālu fibrozi un nieru intersticiālu iekaisuma šūnu infiltrāciju. Turklāt glomerulu elektronu mikroskopiskā attēlveidošana atklāja ļoti iztīrītus, nobarotus un sapludinātus podocītu pēdas procesus ar 80–100 procentiem podocītu PFR. Žurkām tetrandrīna apakšgrupās (vidējas devas un lielas devas grupās) bija mazāk bojājumu nekā ADR grupā ar dažādu apjomu, un uzlabojumi lielu devu grupā bija labāki nekā vidējas devas grupā. Ar zemu, vidēju un lielu tetrandrīna devu ārstētajās grupās podocītu PFR bija attiecīgi 70–80 procenti, 50–60 procenti un 30–40 procenti. Šie dati liecina, ka tetrandrīns aizsargā pret nieru glomerulu strukturāliem bojājumiem, ko izraisīja ADR ievadīšana. Gaismas mikroskopā starp grupām nebija būtiskas atšķirības patoloģiskajās izmaiņās (lielas devas tetrandrīns, CsA un tetrandrīns kombinācijā ar CsA). Turklāt podocītu PFR ar CsA ārstēto ADRN grupā bija tāds pats kā ar lielu tetrandrīnu ārstēto grupu devu.

Diskusija

Podocīti ir kļuvuši arvien svarīgāki kā mērķis intervencei FSGS un ar to saistītajās nefrotiskajās slimībās [20, 21]. Šeit, pamatojoties uz in vitro un in vivo datiem, tā bija

pierādīja, ka tetrandrīna, neselektīva Ca2 plus kanālu bloķētāja, podocītu aizsardzība un antiproteinuriskais efekts tika nodrošināts, inhibējot intracelulāro Ca2 plus pieplūdumu un Ca2 plus atkarīgo kalpaīna-1 signālu kaskādi, tostarp Talin-1 , nefrīns un kalcineirīns. Tetrandrīns bija efektīvāks par kalpaīna{7}} inhibīcijas kavēšanu.

Saskaņā ar iepriekšējiem atklājumiem podocīts TRPC6 ir kanāls, kas galvenokārt veicina Ca2 un pieplūduma izmaiņas normālos un patoloģiskos apstākļos [7, 22]. Ir plaši zināms, ka kalpaīna aktivitāte ir atkarīga no kalcija līmeņa un ir saistīta arnierestraumas, īpaši nieru antiglomerulārais KM bojājums [10, 23]. No 15 identificētajām kalpaīna izoformām nesen tika pierādīts, ka kalpaīns-1 saista TRPC6 aktivitāti ar podocītu bojājumu [24]. Tiek ziņots, ka kalpaīns-1 šķeļ ar podocītu citoskeletu saistīto enkurojošo proteīnu Talin-1 un spraugas diafragmas proteīnu nefrīnu, kas traucē podocītu integritāti un izraisa smagu proteīnūriju [8–12, 16]. Kalcineirīns ir no Ca2 plus atkarīgā fosfatāze, kurai iepriekš ir pierādīta loma podocītos unnieresfunkciju. Uzkrājošie pierādījumi arvien vairāk liecina, ka kalpaīns var proteolītiskā veidā šķelt un aktivizēt kalcineirīnu [25, 26]. Šis pētījums radīja TRPC6 pārmērīgas ekspresijas modeļus ar vīrusu infekciju kultivētos podocītos un adriamicīna injekciju SD žurkām. Atbilstoši tam mēs parādījām, ka TRPC6-mediētais Ca2 plus pieplūdums aktivizēja kalpaīna aktivitāti un kalpaīna ģimenes locekļa kalpaīna-1 izteiksmi. Palielināts kalpaīns-1 vēlāk sašķēla lejteces Talīnu-1 un nefrīnu.

Tetrandrīns ir alkaloīds, kas iegūts no tradicionālā Ķīnas medicīnas auga, un tas ir neselektīvs Ca2 plus kanālu blokators. Šeit tika atkārtoti apstiprināts, ka tetrandrīns kavē TRPC6 pārmērīgu ekspresiju un samazināja Ca2 plus pieplūdumu gan šūnās, gan žurkās, kas pārmērīgi ekspresē TRPC6, kā dokumentēts iepriekš [16]. Vēl svarīgāk ir tas, ka šis pētījums koncentrējas uz tetrandrīna ietekmi uz kalcija atkarīgo pakārtoto signalizācijas ceļu. Tika novērots, ka atšķirībā no CsA tetrandrīns samazināja kalcija aktivētās neitrālās proteāzes (kalpaīna) aktivitāti. Turklāt tetrandrīns samazināja kalcija aktivētās proteāzes grupas kalpaīna -1 ekspresiju un atjaunoja Talīna-1 un nefrīna samazināto ekspresiju. Salīdzinot ar CsA, tetrandrīna ievadīšana uzrādīja labāku ietekmi uz kalpaīna inaktivāciju un samazinātu kalpaīna ekspresiju-1. Šie rezultāti parādīja, ka tetrandrīnam ir terapeitisks potenciāls podocītu bojājumu gadījumā, bloķējot no TRPC6-atkarīgo kalpaīna-1 signalizācijas ceļa aktivāciju.

Ir konstatēts, ka fosfolipāze C (PLC) ir TRPC{0}}saistīšanas partneris [27]. U73122 inhibē PLC, tādējādi samazinot diacilglicerīna veidošanos un samazinot TRPC6 kanāla atvēršanu [18, 24]. Tādējādi U73122 tika izmantots paralēli kā pozitīva kontrole, un tam bija ievērojama ietekme, samazinot intracelulāro Ca2 plus pieplūdumu, kavējot kalpaīna aktivitāti un kalpaīna -1 ekspresiju podocītos, kas pārmērīgi ekspresē TRPC6. Tomēr in vitro citotoksicitātes testi uzrādīja acīmredzamu podocītu toksicitāti.

Šajā pētījumā pēc 12 nedēļām ADR ārstētām žurkām pēc 12 nedēļas ADR injekcijas tika konstatēta nopietna proteīnūrija, hipoalbuminēmija un paaugstināts BUN un Scr līmenis. Gaismas mikroskopija atklāja FSGS, tubulointersticiālu fibrozi un nieru intersticiālu iekaisuma šūnu infiltrāciju ADRN žurkām. Elektronu mikroskopija parādīja plaši izplatītu pēdu procesu izzušanu. In vivo dati arī parādīja, ka tetrandrīna terapija var samazināt proteīnūriju, uzlabot nieru darbību un vājināt glomerulosklerozes progresēšanu. Pēc tetrandrīna terapijas, patoloģiskās izmaiņas gaismas mikroskopā un elektronu mikroskopā, 24-h proteīnūrija, plazmas albumīns, Scr un BUN ADRN žurkām tika ievērojami uzlaboti, salīdzinot ar NC grupā.

Kalcineirīna inhibitors CsA jau sen ir izmantots proteīna ārstēšanainieresslimības [28]. Kalcineirīns ir klīniski nozīmīgs kā imūnsupresīvās zāles CsA tiešs mērķis [17, 29]. CSA samazina kalcineirīna ekspresiju un samazina kalcineirīna mediēto aktivēto T-šūnu kodolfaktoru [30–32]. Jaunākie pierādījumi apstiprina CsA stabilizējošu iedarbību uz podocītu aktīna citoskeletu, piemēram, sinaptopodīnu, bloķējot kalcineirīna izraisīto sinaptopodīna defosforilāciju [17]. Ir arī pierādīts, ka kalpaīns proteolītiskā veidā var šķelt un aktivizēt kalcineirīnu [25, 26]. Šī pētījuma dati atkārtoti apstiprināja, ka CsA inhibēja kalcineirīna aktivitāti un ekspresiju spēcīgāk nekā tetrandrīns. Kā ziņots iepriekš, šķiet, ka CsA tieši neietekmē kalpaīna aktivitāti.

Galvenais pētījuma ierobežojums bija nespēja pierādīt no devas atkarīgu efektu tetrandrīna apakšgrupās (zemas devas, vidējas devas un lielas devas grupas). Viens no iespējamiem izskaidrojumiem varētu būt tas, ka mūsu izmantotais devu diapazons bija pārāk augsts žurkām. Turklāt individuālās atšķirības eksperimentā ar dzīvniekiem var būt ievērojami lielākas nekā devu atšķirības. Salīdzinoši mazais izlases lielums var samazināt statistisko jaudu. Tāpēc ir nepieciešami turpmāki pētījumi, tostarp ievērojami mazākas devas un atbilstošs parauga lielums, lai noskaidrotu precīzu tetrandrīna devu diapazonu un iedarbību ARDN žurkām.

Rezumējot, kalcija signālu ceļu regulēšanā tetrandrīnam bija acīmredzama inhibējoša iedarbība uz kalpaīnu-1, savukārt CsA tieši ietekmēja kalcineirīna inhibīciju. Šie atklājumi liecina, ka kombinēta tetrandrīna un CsA ārstēšana var ietekmēt vairākus kalcija signālu tīkla mērķus, lai uzlabotu klīniskos rezultātus. Ir nepieciešami apstiprinoši pētījumi, lai apstiprinātu šos novērojumus, kā arī noskaidrotu sinerģisko efektu mehānismus.

Saīsinājumi

FSGS: fokusa segmentālā glomerulārā skleroze; MCD: minimālu pārmaiņu slimība; MN: membrānas nefropātija; DKD: Diabētsnieresslimība; TRPC6: pārejoša receptoru potenciāla katjonu kanāla proteīns 6; Ca2 plus: kalcijs; TCM: klasiskā tradicionālā ķīniešu medicīna; Tet: Tetrandrīns; CsA: ciklosporīns A; Scr: seruma kreatinīns; BUN: Asins urīna slāpeklis; PFR: apstrādā saplūšanas ātrumu; BM: Pagraba membrāna; ADRN: adriamicīna izraisīta nefropātija; PLC: fosfolipāze C.

Atsaucietiesnces

1. Garg P. Podocītu bioloģijas apskats. Esmu J Nefrols. 2018;47 (1. pielikums): 3–13.

2. Khalilpourfarshbaf M, Hajiaghaalipour F, Selvarajan KK u.c. Uz mezenhimālām cilmes šūnām balstītas terapijas pret podocītu bojājumiem diabētiskās nefropātijas gadījumā. Audu Eng Regen Med. 2017;14:201–10.

3. Nagata M. Podocītu ievainojums un tā sekas. Kidney Int. 2016;89:1221–30.

4. Pavenstädt H, Kriz W, Kretzler M. Cell biology of the glomerular podocyte. Physiol Rev. 2003;83:253–307.

5. Riehle M, Büscher AK, Gohlke BO u.c. TRPC6 G757D funkciju zaudēšanas mutācija ir saistīta ar FSGS. J Am Soc Nephrol. 2016;27:2771–83.

6. Ilatovskaya DV, Blass G, Palygin O u.c. NOX4 / TRPC6 ceļš podocītu kalcija regulēšanā un nieru bojājumos diabēta nieru slimībā. J Am Soc Nephrol. 2018;29:1917–27.

7. Reiser J, Polu KR, Möller CC u.c. TRPC6 ir ar glomerulāru spraugas diafragmu saistīts kanāls, kas nepieciešams normālai nieru darbībai. Nats Ženē. 2005;37:739–44.

8. Huang H, You Y, Lin X u.c. TRPC6 signāla ceļa kavēšana atvieglo TGF- 1 izraisītos podocītu bojājumus. Cell Physiol Biochem. 2017; 41:163–72.

9. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M u.c. Kalcija atkarīgā proteāze Calpain-1 saista TRPC6 aktivitāti ar podocītu bojājumiem. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2099–109.

10. Peltier J, Bellocq A, Perez J u.c. Kalpaīna aktivācija un sekrēcija veicina glomerulāru bojājumu eksperimentālā glomerulonefrīta gadījumā: pierādījumi no kalpastatīna transgēnām pelēm. J Am Soc Nephrol. 2006;17:3415–23.

11. Tian X, Kim JJ, Monkley SM u.c. Ar podocītiem saistītais talīns1 ir būtisks glomerulārās filtrācijas barjeras uzturēšanai. J Clin izmeklēšana. 2014;124:1098–113.

12. Jiang L, Ding J, Tsai H u.c. Pārmērīga pārejoša receptoru potenciāla katjona kanāla 6 ekspresija podocītos izraisa citoskeleta pārkārtošanos, palielinot intracelulāro Ca2 plus un RhoA aktivāciju. Exp Biol Med (Maywood). 2011; 236:184–93.

13. Liu X, Zhou QG, Zhu XC u.c. Fangji Huangqi tang potenciālo aktīvo komponentu skrīnings nefrotiskā sindroma ārstēšanā, izmantojot integrētu metabolomiku, kuras pamatā ir "ķīmisko un vielmaiņas profilu korelācijas". Front Pharmacol. 2019; 10:1261.

14. Liu KC, Lin YJ, Hsiao YT u.c. Tetrandrīns izraisa apoptozi cilvēka nazofaringeālās karcinomas NPC-TW 039 šūnās ar endoplazmatiskā retikulāta stresu un Ca2 plus / Calpain ceļiem. Pretvēža Res. 2017;37:6107–18.

15. Wang YJ, He LQ, Sun W u.c. Optimizēts tradicionālās ķīniešu medicīnas projekts hroniskas nieru slimības 3. stadijas ārstēšanā: daudzcentru dubultmaskēts randomizēts kontrolēts pētījums. J Etnofarmakols. 2012; 139:757–64.

16. Yu J, Zhu C, Yin J u.c. Tetrandrīns nomāc pārejošu receptoru potenciālu, katjonu kanāla proteīna 6 pārmērīgas ekspresijas izraisītu podocītu bojājumu, bloķējot RhoA/ROCK1 signālu pārraidi. Drug Des Devel Ther. 2020;14:361–70.