1. daļa: Osteoporozes un Alcheimera slimības vienlaikus eksperimentāla modeļa izveide žurkām un ehinakozīda un akteozīda no Cistanche Tubulosa divējāda iedarbība
Mar 24, 2022
Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Yi Chen, Ying-Qi Li, Jia-Yi Fang, Ping Li, Fei Li
KOPSAVILKUMS
Etnofarmakoloģiskā nozīme: Cistanche tubulosair vērtīga tradicionālā ķīniešu medicīna, kas ir plaši izmantota osteoporozes ārstēšanā unAlcheimera slimība. Ehinakozīdsun akteozīds ir galvenās Cistanche tubulosa aktīvās sastāvdaļas, kurām ir farmakoloģiskas aktivitātes ar pētniecisku vērtību. Ir ziņots, ka ehinakozīds unakteozīdsvarētu uzlabot mācīšanās un atmiņas spējas, veicināt osteoblastu proliferāciju un diferenciāciju. Pētījuma mērķis: ehinakozīds un akteozīds noCistanche tubulosair uzrādījušas ievērojamas anti-osteoporozes un anti-Alcheimera slimības aktivitātes, lai gan šie efekti nav pētīti vienlaikus ar žurku modeli. Šī pētījuma mērķis bija izveidot un pārbaudīt osteoporozes modeli kopā arAlcheimera slimībažurkām un izpētīt dubulto ietekmiehinakozīdsun akteozīds šajā vienlaicīgajā modelī.
Materiāli un metodes:Vienlaikus tika noteiktas trīs ovariektomijas (OVX), fiktīvas operācijas ar D-galaktozi un AlCl3 (D), ovariektomijas ar D-galaktozi un AlCl3 (OVX plus D) modeļu grupas. Žurkām narkotiku ārstēšanas grupās tika veikta olnīcu izņemšana. Veicot intraperitoneālu D-galaktozes injekciju un intragastrālu AlCl3 ievadīšanu narkotiku ārstēšanas grupu žurkām, žurkām tika ievadīts iekšķīgi.ehinakozīds(90 mg/kg/d),akteozīds(90 mg/kg/d) un pozitīvās kontroles zāles estradiola valerātu (0.6 mg/kg/d), donepezila HCl (0,8 mg/kg/d). Pēc 8 nedēļu ilgas narkotiku ārstēšanas vispirms tika veikts Morisa ūdens labirinta (MWM) tests 6 dienas. Pēc tam žurkas tika upurētas, lai savāktu asinis, dzemdes, augšstilba kaulus, stilba kaulus un smadzeņu audus. Serums tika izmantots bioķīmiskiem testiem. Dzemdes tika izmantotas histomorfometrijai. Labais augšstilba kauls tika izmantots mikro-CTun histomorfometrija, attiecīgi. Biomehāniskajam testam tika izmantoti labie stilba kauli. Uz ledusskapja savāktais hipokamps tika izmantots bioķīmiskiem testiem. Smadzenes 41, kas savāktas ar perfūziju, tika izmantotas histomorfometrijai.
Rezultāti:Salīdzinot ar Sham grupu, OVX plus D grupa varētu ievērojami samazināt mācīšanās un atmiņas spēju, izraisot oksidatīvus bojājumus, traucējot neironus hipokampā un ietekmējot acetilholīna hidrolīzi un sintēzi. Tikmēr BALP un TRAP aktivitātes OVX plus D grupā ievērojami palielinājās (P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">ehinakozīdsunakteozīds, tipiskās osteoporozes patoloģiskās pazīmes unAlcheimera slimībatika uzlaboti.
Secinājumi:Osteoporozes modelis apvienojumā arAlcheimera slimībažurkām bija iespējams un veiksmīgi konstatēts.Ehinakozīdsun akteozīds arī uzrādīja ievērojamu ietekmi uz šo vienlaicīgo modeli, un tie varētu būt potenciālie 56 kandidāti noCistanche tubulosaar dubultiem efektiem turpmākiem pētījumiem.
Atslēgvārdi:osteoporoze; Alcheimera slimība; divkāršs efekts; ehinakozīds; akteozīds; Cistanche tubulosa
CIstanche Lost Empire garšaugi uzlabo Alcheimera slimību
1. Ievads
Osteoporoze ir deģeneratīva kaulu slimība, kurai raksturīgs progresīvs kaulu masas zudums un mikroarhitektūras iznīcināšana, kas var palielināt trausluma lūzuma risku (Rachner et al., 2011).Alcheimera slimība(AD) ir izplatīta neirodeģeneratīva slimība gados vecākiem cilvēkiem, kam klīniski raksturīgs nepārtraukts garīgs pasliktināšanās, kognitīvi traucējumi un patstāvīgas dzīves spēju zudums (Reitz 76 et al., 2011). Senils aplikuma veidošanās, ko izraisa -amiloīda nogulsnēšanās, tau hiperfosforilācijas izraisīti neirofibrilāri samezglojumi, un neironu deģenerācija smadzenēs ir tipiskas AD patoloģiskās pazīmes (Serrano-Pozo et al., 2011). Virspusēji OP un AD ir pilnīgi neatkarīgas slimības ar atšķirīgu patoloģiju un klīniskām pazīmēm. Tomēr klīniskajā praksē bieži tiek novērots OP un AD vienlaikus (Zhang et al., 2001; Lui et al., 2003; Luckhaus et al., 2009). Abu slimību izplatība pieauga līdz ar vecumu, īpaši sievietēm pēcmenopauzes periodā (Li et al., 2017; Stern, 2012). Arvien vairāk pierādījumu liecina, ka cilvēkiem, kuriem diagnosticēta AD, ir paaugstināts OP risks (Zhou et al., 2014).
Nepieciešams izpētīt un noskaidrot attiecības starp osteoporozi unAlcheimera slimībain vitro un in vivo. Pirms pētījumu veikšanas in vivo ir svarīgi izvēlēties piemērotus osteoporozes vai Alcheimera slimības dzīvnieku modeļus. Osteoporozes modeli var izveidot ar vairāku veidu metodēm, piemēram, intragastrālu retinoīnskābes ievadīšanu, ovariektomijas operāciju un glikokortikoīdu intramuskulāru injekciju (Wei et al., 2007; Komori, 2015). Jo īpaši pēcmenopauzes osteoporozes modelis, ko izraisīja olnīcu izņemšana žurkām, bija klasisks unir plaši izmantots lielākajā daļā pētījumu (Miao et al., 2012; Liu et al., 2017).Sporadiskā Alcheimera slimība ir galvenais Alcheimera slimības veids. Dzīvnieksmodeļi sporādiskiAlcheimera slimībavar izraisīt dažādas metodes, piemēram,D-galaktozes injekcija vai -amiloīds, intragastriska AlCl ievadīšana3,un tā tālāk(Bagheri et al., 2011; Gao et al., 2015; Justin Thenmozhi et al., 2017). Turklāt,Alcheimera slimības konjunkcijas modelis, ko izraisa ilgstoša intraperitoneāla ievadīšanaD-galaktozes injekcija kopā ar olnīcu izņemšanu arī ir daudz pētīta (Liuet al., 2010; Zhao et al., 2012). Lai atklātu osteoporozes aktualitāti unAlcheimera slimību, ir nepieciešams izveidot kombinētās osteoporozes modeliar Alcheimera slimību, lai izpētītu kopējos zāļu mehānismusosteoporoze unAlcheimera slimībaase.
Cistanche tubulosa(Schenk) Wight ir parazitārs augs, kas galvenokārt izplatīts Ķīnas ziemeļrietumu tuksnešos. Žāvēti sulīgi stublājiCistanche tubulosa(CT) tiek izmantotas kā slavenas tonizējošas zāles ar nosaukumu Cistanches Herba ar tās ķīniešu nosaukumu Roucongrong Ķīnas farmakopejā (2015). Tas ir cienīts kā "tuksnešu žeņšeņs", un to plaši izmanto vidukļa un ceļgalu sāpju, sieviešu sterilitātes un aizcietējumu ārstēšanai tradicionālajā ķīniešu medicīnā (Jiang and Tu, 2009). Galvenās CT aktīvās sastāvdaļas ir feniletanoīdu glikozīdi (PhG), ehinakozīds (ECH) unakteozīds(ACT) ir reprezentatīvi savienojumi PhG (Morikawa et al., 2014). Jo īpaši ECH un ACT parasti tiek izvēlēti kā marķieri CT kvalitātes kontrolei to augstā satura un dažādu farmakoloģisko aktivitāšu dēļ, piemēram, neiroprotekcijas, kaulu aizsardzības,
antioksidanti, pretnovecošanās un mācīšanās un atmiņas spēju uzlabošana (Wang et al.,2012. gads; Li et al., 2016). Tomēr ECH un ACT ietekme uz osteoporoziapvienojumā arAlcheimera slimībavēl nav pētītas kopā ar žurku modeli.Tādējādi šī pētījuma mērķis bija izveidot kombinētās osteoporozes žurku modeliar Alcheimera slimību un izpētīt tās ietekmiehinakozīdsun akteozīds uz šovienlaicīgu modeli, lai sniegtu eksperimentālus pierādījumus turpmākai izpēteiehinakozīda vai akteozīda molekulārais mehānisms turpmākajos pētījumos.
cistanche pharma specialpriekšAD
2. Materiāli un metodes
2.1. Dzīvnieki
Astoņdesmit 8-nedēļas vecas Wistar žurku mātītes (sertifikāta numurs: SCXK 2018-0006), kas sver 180–200 g, tika iegūtas no Ķīnas un Lielbritānijas SIPPR/BK Lab. Animal Ltd (Šanhaja, Ķīna) un audzēta Ķīnas Farmācijas universitātes Farmaceitisko dzīvnieku eksperimentālajā centrā.
2.2. Ķīmiskās vielas un reaģenti
Hlorhidrāts, penicilīna G nātrijs, D-galaktoze, alumīnija hlorīda heksahidrāts, estradiola valerāts, donepezila HCl tika iegādāti no Aladdin Industrial Corporation (Šanhaja, Ķīna).Ehinakozīds(HPLC 94 procenti) tika iegūts no Chengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Ķīna).Akteozīds(HPLC 98 procenti) tika iegādāts no Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Ķīna). Kaulu specifiskās sārmainās fosfatāzes (BALP), pret tartrātu rezistentās skābes fosfatāzes (TRAP), superoksīda dismutāzes (SOD), malonaldehīda (MDA), acetilholīnesterāzes (AChE) un holīna acetiltransferāzes (ChAT) enzīmu saistītā imūnsorbcijas testa (ELISA) komplekti bija. iegādāts no Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Šanhaja, Ķīna). Universāls audu fiksators tika iegūts noChengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Ķīna).
ehinakozīds
2.3. Dzīvnieku modeļi un ārstēšana
Visus eksperimentus ar dzīvniekiem atļāva un uzraudzīja Ķīnas Farmācijas universitātes Dzīvnieku ētikas komiteja. Žurkas tika turētas ar 12 stundu gaismas/tumsas ciklu telpā ar kontrolētu temperatūru (22 ± 2 grādi) un barotas ar standarta granulētu lopbarību un krāna ūdeni.
Pēc vienas nedēļas adaptācijas osteoporozes modelis tika sasniegts, veicot ovariektomijas operāciju (French et al., 2008). Pēc operācijas pabeigšanas, lai novērstu infekciju, uz brūces šuves vienu reizi tika uzkaisīts penicilīna G nātrijs. Pēc tam žurkas trīs nedēļas tika barotas normāli. Saskaņā ar atsauci (Hua et al., 2007; Alawdi et al., 2017), modelisAlcheimera slimībavar izraisīt ilgstoša intraperitoneāla D-galaktozes injekcija kopā ar olnīcu izņemšanu vai ilgstošu AlCl3 intragastrālu ievadīšanu. Lai izpētītu osteoporozes modeļa iespējamību kombinācijā ar Alcheimera slimību, trīs ovariektomijas parauggrupas (OVX grupa), fiktīvas operācijas ar intraperitoneālu injekciju 150 mg/kg/d D-galaktozes un intragastrālu ievadīšanu 30 mg/kg/d AlCl3. (D grupa), ovariektomija ar intraperitoneālu injekciju 150 mg/kg/d D-galaktozes un intragastriska ievadīšana 30 mg/kg/d AlCl3 (OVX plus D grupa).
Tāpēc žurkas pēc 3 nedēļām tika nejauši sadalītas astoņās grupās (n{{0}} katrā grupā) un 8 nedēļas perorāli ārstētas ar zālēm: fiktīva grupa; OVX grupa; D grupa; OVX plus D grupa; estradiola valerāta terapijas grupa (EV grupa, OVX plus D plus 0,6 mg/kg/d estradiola valerāts); Donepezil HCl apstrādes grupa (DPZ grupa, OVX plus D plus 0,8 mg/kg/d donepezil HCl);ehinakozīdsārstēšanas grupa (ECH grupa, OVX plus D plus 90 mg/kg/d ehinakozīds);akteozīdsārstēšanas grupa (ACT grupa, OVX plus D plus 90 mg/kg/d akteozīds). Saskaņā ar cilvēka un žurkas ekvivalentās devas pārrēķina principu un devu no saistītās atsauces (Li et al., 2013; Gao et al., 2014), tika pieņemtas zāļu ārstēšanas grupu devas šajā pētījumā.
Katras žurkas ķermeņa svars tika mērīts katru nedēļu. Pēc visas ārstēšanas ar zālēm, kas ilga 8 nedēļas, vispirms tika veikts Morisa ūdens labirinta (MWM) tests 6 dienas. Pēc tam 6 žurkas no katras grupas tika upurētas, lai savāktu materiālus. Žurkas tika anestēzijas ar intraperitoneālu injekciju 30 ml/kg 10% hlorālhidrāta, un asinis tika savāktas no aortas vēdera dobuma. Asinis tika novietotas istabas temperatūrā, lai tās sarecētu, un 10 minūtes centrifugēja ar ātrumu 3500 apgr./min. Serums tika savākts 1,5 ml centrifūgas mēģenē (NEST Biotechnology) un uzglabāts -80 grādos, līdz to izmantoja bioķīmiskiem testiem. Pēc tam tika savākti dzemdes, augšstilba kaula, stilba kauli un smadzeņu audi. Dzemdes tika izmantotas histomorfometrijai. Labais augšstilba kauls tika izmantots attiecīgi mikro-CT un histomorfometrijai. Biomehāniskajam testam tika izmantoti labie stilba kauli. Uz ledusskapja savāktais hipokamps tika izmantots bioķīmiskiem testiem. Pēc tam pārējās trīs žurkas no katras grupas tika perfūzētas no sirds ar fizioloģisko šķīdumu un universālu audu fiksatoru, lai novāktu smadzenes histomorfometrijai.
2.4. Morisa ūdens labirinta (MWM) tests
Žurkas tika pakļautas telpiskās atskaites mācīšanās un atmiņas pārbaudei MWM testā pēc 8 nedēļu ilgas iejaukšanās. MWM tests tika veikts, izmantojot iepriekš aprakstītās metodes (Morris, 1984; Gao et al., 2016). Īsumā, 5 dienas pēc kārtas ar četriem izmēģinājumiem dienā, žurkas tika apmācītas izmantot dažādas vizuālas norādes, kas atrodas uz baseina sienas, lai atrastu slēptu iegremdētu platformu (diametrs 11 cm, augstums 29 cm) apļveida baseinā (diametrs 130 cm, augstums 50 cm) piepildīts ar netoksisku oglekļa tinti tonētu ūdeni. Baseins tika iedomāti sadalīts četros kvadrantos, un četras starta pozīcijas atradās kvadrantu krustpunktos. Platforma atradās viena no kvadrantiem centrā, un izmēģinājumu laikā tā bija nemainīga. Katrā izmēģinājumā žurkas tika nejauši novietotas izvēlētās vietās ar skatu uz baseina sienu. Katrs izmēģinājums tika pārtraukts, kad žurka sasniedza platformu vai pēc 60 sekundēm, un pagājušais laiks tika reģistrēts kā bēgšanas latentums. Žurkas, kas nesasniedza platformu, tika novadītas uz tās. Pēc katra slēptās platformas izmēģinājuma žurka palika uz platformas 10 sekundes. Vidējais latentuma laiks četriem izmēģinājumiem dienā tika aprēķināts kā apmācības rezultāti. 6. dienā visas žurkas tika pakļautas zondes izmēģinājumam, kurā tās 60 sekundes peldēja baseinā bez platformas. Kā galīgie rezultāti tika reģistrēti šķērsošanas laiki platformas atrašanās vietā un ceļojuma laiks mērķa kvadrantā. Žurkas tika uzraudzītas ar kameru, kas uzstādīta griestos tieši virs baseina, un visi izmēģinājumi tika reģistrēti un analizēti, izmantojot programmu MORRIS MAZE, ko piegādāja Beijing Zhongshidichuang Science and Technology Development Co., Ltd. (Pekina, Ķīna).
2.5. Bioķīmiskais tests ar ELISA
Saskaņā ar ELISA komplektu ražotāja norādījumiem BioTek Synergy testēja kaulu specifisko sārmainās fosfatāzes (BALP) aktivitāti, pret tartrātu rezistento skābes fosfatāzes (TRAP), superoksīda dismutāzes (SOD) aktivitāti un malondialdehīda (MDA) saturu serumā. 2 vairāku režīmu mikroplašu lasītājs (BioTek, ASV). Katras grupas hipokampa audi tika mazgāti ar PBS (0,01 M, pH 7,4), lai noņemtu asinis vai netīrumus, kas palikuši uz audu virsmas. Hipokampa audi vienā pusē tika nosvērti un pēc tam sagriezti pēc iespējas mazākos gabaliņos. Hipokampa audi tika homogenizēti saskaņā ar attiecību 1: 9 (audu svars: PBS tilpums). Homogenātu centrifugēja pie 4 grādiem, 3000 apgr./min 15 minūtes. Supernatants tika savākts un atšķaidīts, lai izmērītu proteīna koncentrāciju ar BCA metodi. Pēc tam ar ELISA metodēm tika pārbaudīta acetilholīnesterāzes (AChE) aktivitāte, holīna acetiltransferāzes (ChAT) aktivitāte, superoksīda dismutāzes (SOD) aktivitāte un malondialdehīda (MDA) saturs hipokampa audos.
2.6. Hipokampa histomorfometrija
Smadzeņu audi (n=3/grupa) tika fiksēti universālā audu fiksatorā. Pēc tam smadzeņu audu paraugi tika mazgāti, dehidrēti ar gradienta etanolu, iestrādāti ar parafīna vasku un sagriezti 5 μm koronālās daļās. Sekcijas tika iekrāsotas ar hematoksilīnu un eozīnu (HE). Pēc tam smadzeņu audu koronālās sekcijas tika fotografētas ar apgrieztu fluorescences mikroskopu (Nikon, Japāna). Īpaši tika novērotas CA1, CA2, CA3 un DG morfoloģiskās izmaiņas hipokampā.
2.7. Dzemdes histomorfometrija un morfometrija
Atlasītās dzemdes (n{{0}}/grupa) tika fiksētas universālā audu fiksatorā. Pēc tam dzemdes audu paraugi tika mazgāti, dehidrēti ar gradienta etanolu, iestrādāti ar parafīna vasku un sagriezti 5 μm šķērsgriezumos. Sekcijas tika iekrāsotas ar hematoksilīnu un eozīnu (HE). Tika novēroti un fotografēti dzemdes šķērsgriezumi. Pēc nejaušības principa tika atlasīti pieci redzes lauki, pēc tam, izmantojot Image-Pro Plus 6.0 programmatūru, tika mērīts dzemdes šķērsgriezuma diametrs un dzemdes gļotādas epitēlija biezums. Tika skaitīts arī dzemdes dziedzeru skaits lamina propria.
2.8. Mikro-CT
Atlasītais labais augšstilba kauls (n=3/grupa) tika skenēts tādā pozīcijā, kurā objekta attālums līdz avotam bija 121 mm un kameras attālums līdz avotam 171 mm, izmantojot SkyScan 1176 micro X- staru datortomogrāfija (mikro-CT) skeneris (Bruker, Vācija). Par atsauces virsmu tika izvēlēta distālā augšanas plāksne. Ar attālumu 1 mm zem atsauces virsmas kā interesējošais tilpums tika izvēlēts 1, 8 mm biezs apgabals (VOI, 100 slāņi). Iegūto pelēktoņu attēlu pikseļu izmērs bija 17, 76 μm no kaula rekonstrukcijas (65 kV, 385 μA). Lai atlasītu trabekulas no garozas kaula, tika izmantota daļēji automatizēta kontūru veidošanas metode. Tiešās 3D mērījumu metodes tika izmantotas, lai novērtētu kaulu tilpuma procentus (BV/TV), kaulu virsmas blīvumu (BS/TV), trabekulāro atdalīšanu (Tb. Sp), trabekulāro skaitu (Tb. N), trabekulāro biezumu (Tb. Th). , struktūras modeļa indekss (SMI), trabekulārā modeļa faktors (Tb. Pd) un vidējais kaulu minerālais blīvums (vidējais KMB) tam pašam VOI, izmantojotCTAnalizatoru programma (Bruker, Vācija). VOI 3D vizualizācija, izmantojot adaptīvo renderēšanas algoritmu, tika veikta ar CTvol programmatūru (Bruker, Vācija).
cistanche augu ekstrakts
2.9. Kaulu histomorfometrija
Atlasītais labais augšstilba kauls (n=3/grupa) tika fiksēts universālā audu fiksatorā un pēc tam atkaļķots 10% EDTA-2Na šķīdumā 3 nedēļas. Atkaļķotie paraugi tika mazgāti, dehidrēti ar gradienta etanolu, iestrādāti ar parafīna vasku un sagriezti 5 μm gareniskajās daļās. Sekcijas tika iekrāsotas ar hematoksilīnu un eozīnu (HE). Tika nofotografēti augšstilba kaula garengriezumi. Tika novērotas katras grupas kaulu audu struktūras, īpaši trabekulārās kaulu struktūras.
2.10. Biomehāniskā pārbaude
Nejauši izvēlētie labie stilba kauli (n=4/grupa) tika novērtēti trīspunktu lieces testam, izmantojot universālu testēšanas iekārtu (SHIMADZU, Japāna). Šo paraugu diametri tika mērīti ar nonija suportu diapazonā no 2.16-2.38 mm (d). Pēc tam paraugs tika novietots uz diviem atbalsta šķērsstieņiem ar 25 mm (L) attālumu starp abām sliedēm, un parauga fizioloģiskais izliekums bija uz augšu. Slodzes stienis atradās parauga centrā un kritās ar nemainīgu ātrumu 1,5 mm/min, līdz paraugs tika salauzts. Spēka (F) un pārvietojuma dati tika automātiski ierakstīti datorā, kas bija savienots ar testēšanas iekārtu, un vienlaikus tika uzzīmēta slodzes-deformācijas līkne. Maksimālās slodzes (N) un enerģijas absorbcijas (mJ) vērtības tika reģistrētas vienlaikus ar materiālu testēšanas programmatūru TRAPEZIUM X. Maksimālā sprieguma (MPa) vērtības tika aprēķinātas pēc šādas formulas: Spriegums (σ)=lieces moments (M) / Sekcijas koeficients (Z)=(8×L×F) / ( π×d3)
2.11. Statistiskā analīze
Modeļu grupu rezultāti tika salīdzināti ar fiktīvu grupu, un ar zālēm ārstēto grupu rezultāti tika salīdzināti ar OVX plus D grupu. Dati tika analizēti, izmantojot vienvirziena ANOVA, kam sekoja Bonferroni vairāku salīdzināšanas testu, izmantojot Graph Pad Prism 5.{3}} programmatūru. Dati tika izteikti kā vidējais ± SD, un P vērtības, kas bija mazākas par 0,05, tika uzskatītas par statistiski nozīmīgām.
miricetīnsuncistanche
